降维分类方法：以改进质谱流式细胞识别技术

原文：Automatic classification of cellular expression by nonlinear stochastic embedding (ACCENSE)
作者：Karthik Shekhar, Petter Brodin, Mark M.Davis and Arup K.Chakraborty.
来源：Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), 2014, 111(1): 202-207.
转载：简书不支持公式渲染，便于阅读可参考原博文。

更新

2018.11.22：降维算法部分写得不太明撩，重新整理部分描述。

摘要

质谱流式细胞技术 ( Mass cytometry ) 能够在单细胞水平上识别到近 40 种不同的蛋白质，即提供前所未有的多维信息。由于各式各样的细胞种群数据集的复杂性，要收集有用的生物学知识对计算工具也有新的要求。回顾之前的聚类方法，聚类需要特征 ( 维度 )，而每一种蛋白质 ( 细胞表征由不同蛋白质表示 ) 可当作一种特征，聚类算法就会自动识别不同类型的簇群，即对于不同功能的细胞识别是基于细胞表征相似性来实现区分的。当然，经典方法存在一定局限性，例如单细胞分辨率的损失 ( 特征或维度的减少 )；经典方法需要预知簇中的对象数量 ( 本文中指细胞亚群的规模数量 )。

而该论文引入 ACCENSE ( Automatic classification of cellular expression by nonlinear stochastic embedding ) 高维单细胞数据分析工具：

基于密度划分的非线性降维方法，降维方法采用 t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) 算法 $^{[1]}$ 。
该算法非常适合于探索性数据分析，同时避免任何手动 阀门(阈值) 的需要，即有别于基于距离的方法 ( 离群点判定 )、基于密度的方法 ( 密度阈值设定 )。
化繁为简，在二维或三维图上展示不同功能的多元细胞群。

再有，本论文将 ACCENSE 应用于 35 参数的质谱流式细胞技术，检测 CD8+ T 细胞的数量 ( 数据来自于特定的无病原和无菌小鼠 )，并将细胞分层到表型亚群中。需要说明的是，对于具体的聚类算法、降维算法中，特定的符号名称会以具体的对象名称替代。

正文

背景介绍

免疫系统包含了许多类型的细胞，它们在免疫应答过程中表现出多样化的功能和复杂方式的相互作用，即通过不同蛋白质的表征所定义，故个体细胞的功能与其细胞表型密切相关。这里启示我们，对于不同功能的细胞可通过细胞表型相似性进行聚类区分。
传统流式细胞技术和质谱流式细胞技术的区别：
- 传统流式细胞技术 ( Flow Cytometry ) $^{[2]}$ 中，用 荧光基因 标记的抗体染色，其通过单细胞分辨率的光发射信号对靶标蛋白进行量化。且由于有限的光谱和重叠的发射信号，每个细胞限制为 12-16 个参数进行量化。
- 质谱流式细胞技术 ( Mass Cytometry ) $^{[3]}$ ，使用 金属螯合探针 可对单个细胞多达 42 个参数的进行量化。
- 传统流式细胞技术和质谱流式细胞技术相比，主要有两点不同：
  - 标签系统的不同，前者主要使用各种荧光基团作为抗体的标签，后者则使用各种金属元素作为标签；
  - 检测系统的不同，前者使用激光器和光电倍增管，而后者使用 ICP 质谱技术。

聚类算法

由 质谱流式细胞技术产生的高维数据，以生物学的方式解释是具有挑战性的。然而，很多聚类工具是基于细胞的蛋白表达相似性进行细胞分类的，
例如，SPADE 算法 使用多元信息定义细胞簇，并在树状结构中显示潜在的表型层次结构。但尚有不足之处：
- 一是单细胞分辨率的损失；
- 二是对目标集群数量的需要预知。

降维算法

关于 降维算法 在另外一篇博文也有提及，不妨参考学习：利用 t-SNE 降维并可视化数据。

同样，降维算法以细胞表征 ( 由不同蛋白质表示 ) 的相似性为依据，把空间组织的细胞群在低维空间上聚类成不同的细胞亚群。以下罗列一些常见的降维算法。
PCA 算法：PCA 降维的大致思想就是，挑选特征明显的、显得比较重要的信息保留下来。在本论文中，Newell 等人将主成分分析 ( Principal component analysis，PCA ) 应用于 25 参数的质谱流式细胞技术，检测人的 CD8+ T 细胞的数量，且使用前三种主成分 ( 3D-PCA ) 分离细胞亚群。3D-PCA 以三个汇总变量表示数据，每个汇总变量都是原始维度的 线性组合，并去捕获投影后数据的方差，直至其取值为最大值。然而，PCA 能在数据中所有的可能线性组合中找到最优表达，但也存在限制条件：线性投影可能太严格而不能产生精确的表示 $^{[6]}$ ，故作者引入 t-SNE 算法继续展开研究。
t-SNE 算法 $^{[7]}$ ：t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding，数据降维与可视化的方法，具体的算法细节如下：
- 让 $\{x^{(i)}\}$ 表示归一化的 N 维蛋白质表达向量编码的细胞表型 i ( i=1, 2, ..., M )。
- 若在 2D 平面图下， $\{y^{(i)}\}$ 向量是高维向量 $\{x^{(i)}\}$ 对应于低维的映射，它使得具有相似表型的 T 细胞彼此靠近嵌入，表型不相似的则嵌入相对较远的距离。
- 采用细胞 i 和 j 之间的成对概率 $\{p_{i,j}\}$ 表示 $\{x^{(i)}\}$ 与 $\{x^{(j)}\}$ 之间的相似性。
- 若在 2D 平面图下，成对概率 $\{q_{i,j}\}$ 表示 $\{y^{(i)}\}$ 与 $\{y^{(j)}\}$ 之间的相似性。
- 通过最小化 $\{p_{i,j}\}$ 与 $\{q_{i,j}\}$ 的 KL 散度 ( 可理解为代价函数 )，然后找出 "最佳" 嵌入向量 $\{y^{(i)}\}$ ，即它表示的意义是，高维转低维的表示信息能最大程度被保存下来。
  
  K-L 散度 ( 详细见附录 1 )，Kullback-Leibler Divergence，又称相对熵，即描述两概率分布 P 和 Q 的差异。KL 散度公式 (1) 如下：
$D_{KL}(\{p_{i,j}\}|\{q_{i,j}\}) = \sum_{i,j} p_{i,j} log \frac{p_{i,j}}{q_{i,j}} \tag{1}$
- $\{y^{(i)}\}$ 可以编码非线性关系，不像 PCA 中被约束为 $\{x^{(i)}\}$ 的线性组合。
- 最佳嵌入 是通过数值梯度下降法来确定的，即所有数据点的 KL 散度总和减小到最小 ( 详细见附录 2 )。

识别细胞亚群

使用一个高斯核函数，把 t-SNE 的二维细胞散点图加工成 复合图像，如图 1-1 (D) 所示。其中， $K_\gamma(y)$ 通过计算低维空间中所有细胞的位置总和，以表示 t-SNE 二维映射图中细胞的局部密度：

$K_\gamma(y) = (2 \pi \gamma^2)^{-1} \sum_{y' \in Y}exp( -\frac{||y - y'||^{2}}{2\gamma^2}) \tag{2}$
在本论文中， $K_\gamma(y)$ 的 局部最大值 表示具有共同表型的 CD8+ T 细胞亚群，且使用了 Matlab 的峰值检测算法识别这些局部最大值。

当然，也可以在嵌入点上使用 K-Means 聚类算法来识别 T 细胞子集，但其要求事先指定簇的数量。
如何求得 局部最大值，关键是对于公式 (2) 中 $\gamma$ 的参数设定多少有关。即通过比较不同的核-带宽 $\gamma$ 产生的结果，则存在一个 $\gamma$ 值为表型空间中的局部和全局特征提供了准确的粗粒度表示。从图 1-2 中可得，即启示我们可以以数据驱动的方式，求得较合适的 $\gamma$ 值，以近似地识别 CD8+ T 细胞的细胞亚群。

附录

1 t-SNE 中的概率

$p_{i,j}$ 概率

基于蛋白质相似性，设 $p_{j|i}$ (i,j = 1, 2, ..., M) 表示细胞 i 将选择细胞 j 作为其最近邻的概率 ( $p_{j|i}$ 越大， $x^{(i)} 和 x^{(j)}$ 越近 )：

$p_{j|i} = \frac{ exp({-||x^{(i)} - x^{(j)}||^2} / { 2\sigma_i^2}) }{ \sum_{k \neq i} exp({-||x^{(i)} - x^{(k)}||^2} / { 2\sigma_i^2}) }, d_{i,j} = ||x^{(i)} - x^{(j)}||_2 \tag{3}$

对于概率 $p_{j|i}$ 的几点说明：
- $d_{i,j}$ 可以使用其他距离范式替代欧式距离范式；
- 原始的 SNE 算法是不对称的，为简化梯度公式，t-SNE 中让公式 (3) 的条件概率是对称的。即初始化 $p_{i|i} = 0$ ( 只考虑不同点两两之间的相似度 )，对于任意的 $p_{i|j} = p_{j|i}$ ，可得：
$p_{i,j} = \frac{ p_{j|i} + p_{i|j} }{2M} = \frac{ exp({-d_{i,j}^2} / { 2\sigma_i^2}) }{ \sum_{k \neq i} exp({-d_{i,k}^2} / { 2\sigma_i^2}) } \tag{4}$
不同的点 $x_i$ ，方差 $\sigma_i$ 的取值也是不同的。
- 公式 (3) 中的方差 $\sigma_i$ 是确保对于每一个细胞都有相同的困惑度 ( Complexity )。复杂度可理解为一个点附近的 有效近邻点个数。
- 定义复杂度为 $P_i = 2^{H_{j|i}}$ ，其近似地解释为细胞 i 的最近邻点的数量。
- 定义 $p_{j|i}$ 的香农熵 (信息熵) 为 $H_{j|i} = - \sum_j p_{j|i} \log_2 p_{j|i}$ ，且 $H_{j|i}$ 随着 $\sigma_i$ 的增加而增加。
  
  在本论文中，t-SNE 图谱的复杂度被设定为 30，即 10-50 范围内的复杂度对最终结果的影响不大 (较好的鲁棒性)。

$q_{i,j}$ 概率

对于低维度下的 $\{y_i\}$ ，在原始的 SNE 算法 $^{[7]}$ 中 Hinton 和 Rowers 引用高斯分布函数定义 $q_{i,j}$ ，但在低维表达中发现了 拥挤问题。

拥挤问题：就是说各个簇聚集在一起，无法区分。譬如，有一高维度数据在降维到 10 维下可以有很好的表达，但是降维到两维后无法得到可信映射。具体情况是，10 维中有数个点之间两两等距离的，在二维下就无法得到可信的映射结果。

进一步说明，假设一个以数据点 $x^i$ 为中心，半径为 r 的 m 维球(三维空间就是球)，其体积是按 $r^m$ 增长的，假设数据点是在 m 维球中均匀分布的，我们来看看其他数据点与 $x^i$ 的距离随维度增大而产生的变化。
t-SNE 减轻了拥挤问题，即使用更加偏重长尾分布的方式来将距离转换为概率分布 $^{[8]}$ ，故有 $q_{i,j}$ ：

$q_{i,j} = \frac{ (1 + ||y^{(i)} - y^{(j)}||^2)^{-1} }{ \sum_{k \neq i} (1 + ||y^{(i)} - y^{(k)}||^2)^{-1} }, \Delta_{i,j} = ||y^{(i)} - y^{(j)}||^2 \tag{5}$
同样地，对于概率 $q_{i,j}$ 的几点说明：
- $\Delta_{i,j}$ 可以使用其他距离范式替代欧式距离范式；
- 原始的 SNE 算法是不对称的，为简化梯度公式，t-SNE 中让公式 (5) 的条件概率是对称的。即初始化 $q_{i|i}=0$ ，对于任意的 $q_{i|j} = q_{j|i}$ 。

2 数值梯度下降法

在 [7] 中的概述过程，获得优化的梯度公式，如下所示:

$\frac{ \partial D_{KL}(\{p_{i,j}\} | \{q_{i,j}\}) }{ \partial_{y_t}^{(i)} } = 4 \sum_j \frac{ (p_{i,j} - q_{i,j}) }{ (1 + ||y_t^{(i)} - y_t^{(j)}||^2) } (y_t^{(i)} - y_t^{(j)}) \tag{6}$
通过梯度下降法迭代计算局部最大值：

$y_{t+1}^{(i)} = y_{t}^{(i)} + \eta(t) \frac{ \partial D_{KL}(\{p_{i,j}\} | \{q_{i,j}\}) }{ \partial_{y_t}^{(i)} } + \alpha(t)(y_{t}^{(i)} - y_{t-1}^{(i)}) \tag{7}$
- $y_t^{(i)}$ 表示迭代 t 次的解， $\eta(t)$ 表示学习速率， $\alpha(t)$ 表示迭代 t 次的动量。
- 学习速率初始值为 $\eta(t) = 100\,^{[9]}$ ，且动能量 $\alpha(t)$ 设定为：
$\alpha(t) = \begin{cases} 0.8, & t < 300 \\ 0.5, & t \geq 300 \end{cases}$

不足

t-SNE 主要用于可视化，很难用于其他目的。譬如测试集合降维，因为他没有显式的预估部分，不能在测试集合直接降维。
关于核-带宽 $\gamma$ 参数设定问题：文中展示了 $\gamma$ 参数的大小与识别细胞亚群能力的数量关系。然而，数据驱动方式虽能实现自动聚类，但缺乏对于 $\gamma$ 参数设定范围该如何控制的说明。

参考

[1] Maaten L, Hinton G. Visualizing data using t-SNE [J]. Journal of machine learning research, 2008, 9(Nov): 2579-2605.
[2] Cantor H, Simpson E, Sato V L, et al. And functional studies of peripheral t-cells binding different amounts of fluorescent anti-thy 1.2 (theta) Antibody using a fluorescence--activated cell sorter (FACS) [J]. 1975.
[3] Bendall S C, Nolan G P, Roederer M, et al. A deep profiler's guide to cytometry [J]. Trends in immunology, 2012, 33(7): 323-332.
[4] Qiu P, Simonds E F, Bendall S C, et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE [J]. Nature biotechnology, 2011, 29(10): 886.
[5] Bendall S C, Simonds E F, Qiu P, et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum [J]. Science, 2011, 332(6030): 687-696.
[6] Van Der Maaten L, Postma E, Van den Herik J. Dimensionality reduction: a comparative [J]. J Mach Learn Res, 2009, 10: 66-71.
[7] Maaten L, Hinton G. Visualizing data using t-SNE [J]. Journal of machine learning research, 2008, 9(Nov): 2579-2605.
[8] Chrispher. t-SNE 完整笔记 [OL]. www.datakit.cn. 2017.
[9] Jacobs R A. Increased rates of convergence through learning rate adaptation[J]. Neural networks, 1988, 1(4): 295-307.

最后编辑于：2022.10.16 00:53:23

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1 t-SNE 中的概率

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2 数值梯度下降法

不足

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