在此示例工作流程中，我们演示了最近在论文中介绍的两种新方法，即单细胞数据的全面集成：
- 将多个不同的scRNA-seq数据集组装成一个集成参考
- 将单元格类型标签从参考数据集转移到新的查询数据集
出于本示例的目的，我们选择了通过四种技术（CelSeq（GSE81076）CelSeq2（GSE85241），Fluidigm C1（GSE86469）和SMART-Seq2（E-MTAB-5061））生成的人胰岛细胞数据集。为方便起见，我们通过SeuratData软件包分发此数据集。
新方法的代码在Seurat v3中实现。您可以使用从CRAN下载并安装install.packages。
install.packages("Seurat")
除新方法外，Seurat v3包括许多旨在改善Seurat对象和用户交互的改进。为了帮助用户熟悉这些更改，我们为常见任务整理了一份命令备忘单。
数据集预处理
加载数据集。元数据包含四个数据集中每个单元的技术（tech列）和单元类型注释（celltype列）。
library(Seurat)
library(SeuratData)
InstallData("panc8")
为了构建参考，我们将识别各个数据集之间的“锚”。首先，我们将合并的对象分成一个列表，每个数据集都作为一个元素。
data("panc8")
pancreas.list <- SplitObject(panc8, split.by = "tech")
pancreas.list <- pancreas.list[c("celseq", "celseq2", "fluidigmc1", "smartseq2")]
在找到定位点之前，我们执行标准预处理（对数归一化），并分别为每个特征确定可变特征。请注意，Seurat v3基于方差稳定化转换（"vst"）实现了一种改进的可变特征选择方法。
for (i in 1:length(pancreas.list)) {
pancreas.list[[i]] <- NormalizeData(pancreas.list[[i]], verbose = FALSE)
pancreas.list[[i]] <- FindVariableFeatures(pancreas.list[[i]], selection.method = "vst",
nfeatures = 2000, verbose = FALSE)
}
整合3个胰岛细胞数据集
接下来，我们使用FindIntegrationAnchors函数识别锚点，该函数将Seurat对象列表作为输入。在这里，我们将三个对象集成到一个引用中（在本小插图的后面将使用第四个对象）
我们在这里使用所有默认参数来识别锚点，包括数据集的“维度”（30；随时尝试在较大范围内（例如10到50之间）更改此参数）。
reference.list <- pancreas.list[c("celseq", "celseq2", "smartseq2")]
pancreas.anchors <- FindIntegrationAnchors(object.list = reference.list, dims = 1:30)
然后，我们将这些锚点传递给IntegrateData函数，该函数返回Seurat对象。
返回的对象将包含一个new Assay，它为所有单元格保留一个集成的（或“批处理校正”的）表达矩阵，从而可以对它们进行联合分析。
pancreas.integrated <- IntegrateData(anchorset = pancreas.anchors, dims = 1:30)
运行后IntegrateData，该Seurat对象将包含Assay带有集成表达式矩阵的新对象。请注意，原始值（未校正的值）仍存储在“ RNA”分析中的对象中，因此您可以来回切换。
然后，我们可以使用这个新的集成矩阵进行下游分析和可视化。在这里，我们可以缩放集成数据，运行PCA并使用UMAP可视化结果。集成的数据集按单元类型而不是技术进行聚类。
library(ggplot2)
library(cowplot)
library(patchwork)
# switch to integrated assay. The variable features of this assay are automatically
# set during IntegrateData
DefaultAssay(pancreas.integrated) <- "integrated"
# Run the standard workflow for visualization and clustering
pancreas.integrated <- ScaleData(pancreas.integrated, verbose = FALSE)
pancreas.integrated <- RunPCA(pancreas.integrated, npcs = 30, verbose = FALSE)
pancreas.integrated <- RunUMAP(pancreas.integrated, reduction = "pca", dims = 1:30)
p1 <- DimPlot(pancreas.integrated, reduction = "umap", group.by = "tech")
p2 <- DimPlot(pancreas.integrated, reduction = "umap", group.by = "celltype", label = TRUE,
repel = TRUE) + NoLegend()
p1 + p2
使用集成参考进行细胞类型分类
Seurat v3还支持将参考数据（或元数据）投影到查询对象上。尽管许多方法都是保守的（两个过程都从标识锚点开始），但数据传输和集成之间有两个重要区别：
在数据传输中，Seurat不会更正或修改查询表达式数据。
在数据传输中，Seurat有一个选项（默认设置），可以将引用的PCA结构投影到查询上，而不是通过CCA学习联合结构。我们通常建议在scRNA-seq数据集之间投影数据时使用此选项。
找到锚点后，我们使用该TransferData函数根据参考数据（参考单元格类型标签的向量）对查询单元格进行分类。TransferData返回具有预测ID和预测得分的矩阵，我们可以将其添加到查询元数据中。
pancreas.query <- pancreas.list[["fluidigmc1"]]
pancreas.anchors <- FindTransferAnchors(reference = pancreas.integrated, query = pancreas.query,
dims = 1:30)
predictions <- TransferData(anchorset = pancreas.anchors, refdata = pancreas.integrated$celltype,
dims = 1:30)
pancreas.query <- AddMetaData(pancreas.query, metadata = predictions)
因为我们具有来自完整集成分析的原始标签注释，所以我们可以评估预测的单元格类型注释与完整参考的匹配程度。在此示例中，我们发现细胞类型分类有很高的共识，超过97％的细胞被正确标记。
pancreas.query$prediction.match <- pancreas.query$predicted.id == pancreas.query$celltype
table(pancreas.query$prediction.match)
##
## FALSE TRUE
## 18 620
为了进一步验证这一点，我们可以检查一些特定胰岛细胞群体的典型细胞类型标记。请注意，即使其中一些细胞类型仅由一个或两个细胞（例如epsilon细胞）表示，我们仍然能够正确分类它们。
table(pancreas.query$predicted.id)
##
## acinar activated_stellate alpha beta
## 21 17 248 258
## delta ductal endothelial epsilon
## 22 33 13 1
## gamma macrophage mast schwann
## 17 1 2 5
VlnPlot(pancreas.query, c("REG1A", "PPY", "SST", "GHRL", "VWF", "SOX10"), group.by = "predicted.id")
参考
