Nat Biotech | 单细胞测序鉴定小分子药物应答机理

原创 huacishu 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学技术

撰文：huacishu

IF=54.903

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亮点：

1、TraCe-seq平台能够通过追踪暴露于不同EGFR靶向治疗后有反应和持续存在的细胞，并进行差异基因分析和时间轨迹比较。。

2、研究揭示了EGFR抑制剂反应的一个令人兴奋且以前未被认可的组成部分：由抑制剂结合的EGFR引起的内质网应激的诱导对于实现完全疗效至关重要。

3、作者认为深入了解抑制剂结合EGFR和内质网应激诱导的生化机制有助于将来开发靶向EGFR和其他膜相关蛋白的小分子药物。

近日来自Genentech Inc.的高级研究员Xin Ye博士团队在国际知名期刊Nat Biotechnol在线发表题为“Identifying transcriptional programs underlying cancer drug response with TraCe-seq”的研究论文。针对致癌驱动基因突变的靶向治疗为癌症患者提供了显著的临床治疗效果，并为精确医学带来了巨大的希望。然而，并非所有携带这种突变的个体都有相同的抗癌反应。尽管直接抑制致癌因子（可能是小分子激酶抑制剂成功的最好例证）仍然是精确治疗的一个组成部分，但新的治疗模式也在探索中。近年来，一种新的作用机制（MOA），即靶向蛋白质降解，比传统的基于占有率的靶向抑制越来越受到人们的关注。异源双功能靶向蛋白质降解剂，即能够同时将E3泛素连接酶招募到目标并通过泛素介导的蛋白质水解诱导靶向降解的分子，已经获得了研究者的极大的兴趣，并且已经证明在特定情况下优于单独的酶抑制。然而，目前尚不清楚双作用抑制剂-降解剂是否具有普遍优势。

目前描述药物反应和耐药性的范例在很大程度上依赖于长期药物暴露后的最终评估。虽然这一过程可以有效地识别耐药机制，但它发现先前存在的特征和早期适应性变化的能力有限，这些特征和变化使特定亚群得以持续存在。作者推断，一个同时追踪肿瘤细胞起源并比较肿瘤细胞对不同疗法的即时反应的系统可以大大加速药物反应或者耐药性研究。这样一个系统可以直接比较不同疗法的疗效和MOA，从而加速未来疗法的发展。为此，作者开发了TraCe-seq，通过同时测量接受抗癌治疗的异质人群中的克隆适合度及其转录轨迹，快速捕捉治疗反应的起源和早期适应性过程（图1a）。该方法能够在亚群和单细胞分辨率下对不同治疗方式进行直接和全面的比较。为了建立TraCe-seq，构建了一个3′scRNA-seq兼容的慢病毒条形码库，每个条形码由30 nt区域组成。成功转导后，慢病毒载体将稳定整合到基因组中，导致选择标记、嘌呤霉素抗性和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的组成性表达，以及嵌入3′-未翻译区域的条形码（图1b）。虽然靶向EGFR的小分子策略集中于抑制其酶活性，但与酶抑制相比，EGFR降解的潜在结果知之甚少。为此，作者开发了GNE-104，一种由EGFR抑制剂厄洛替尼连接到von Hippel–Lindau（VHL）结合部分（CRL2–VHL E3连接酶复合物的底物结合成分）组成的异源双功能降解剂。GNE-104诱导EGFR的显著剂量和VHL依赖性降解，并有效抑制磷酸化EGFR水平（图1c）。同时还制备了一种非降解物对照品GNE-069（图1c），该对照品不能与VHL结合并降解EGFR，同时保留了与GNE-104体外激酶抑制试验中观察到的效力和选择性相当的特性。然后，在每个条件下接种200000个细胞，并用厄洛替尼、GNE-104或GNE-069处理它们。在第4天收集细胞，并用10x scRNA seq分析，以确定每个克隆的相对适合度，并捕获处理诱导的转录变化（图1d）。为了证实TraCe-seq方法能够准确测量基线时的相对克隆大小，在DMSO中扩增了20000个条形码细胞7天，并通过对基因组DNA进行饱和条形码分析对这些细胞进行了分析。事实上，scRNA-seq测定的克隆丰度与基因组DNA分析高度相关。治疗前，在基线检查时恢复了551个条形码（图1e）。与观察到的GNE-104生长抑制活性降低相一致，GNE-104处理在减少微量序列条形码的绝对数量和多样性方面效果较差（图1e）。此外，尽管在所有治疗条件下都观察到类似的MAPK通路抑制（图1f），但厄洛替尼和GNE-069诱导的细胞周期阻滞（G0）远远大于GNE-104（图1g），这表明GNE-104治疗允许更多细胞持续存在MAPK通路抑制。在多个EGFR突变的肺癌细胞系中证实了GNE-104的抗生长作用降低。这种疗效的丧失并非由于活性VHL配体的存在，因为10倍高浓度的游离VHL配体不会影响对厄洛替尼或GNE-069的反应。

为了进一步了解PC9细胞在克隆水平上对这些处理的差异反应，作者试图将处理过的群体与起始群体相比表现过度或不足的微量序列条形码进行分类。与未处理群体相比，在处理群体中过度表达的TraCe-seq条形码被分为三类抗性克隆（图2a），而根据对激酶抑制剂和降解物的反应，治疗后代表性不足的条形码被分为三类敏感克隆。特别是，与激酶抑制剂处理相比，GNE-104处理导致一组独特的微量序列条形码过度表达；这些条形码被归类为抗降解剂（图2a）。我们通过比较激酶抑制剂抗性克隆和激酶抑制剂敏感克隆之间的基线基因表达，进行无偏差异基因表达分析，寻找可能导致激酶抑制剂（厄洛替尼和GNE-069）抗性的先前存在的转录特征。与之前的报道一致，结果发现在治疗前，VIM和AXL在激酶抑制剂耐药细胞中显著上调（图2b），证实TraCe seq成功捕获了预期的耐药亚群和相关分子标记。值得注意的是，作者发现降解物抗性克隆仅显示AXL表达升高，但未显示VIM上调，这表明它们确实在转录上不同于激酶抑制剂抗性克隆（图2b）。为了揭示什么转录程序可以使细胞在降解剂处理下存活，又进行了无偏差基因集表达分析，比较了降解剂抗性克隆和敏感克隆内质网活性中的蛋白质加工被发现是降解抗性克隆和降解敏感克隆之间最显著和最丰富的途径（图2c），表明内质网蛋白加工基因表达较低的细胞可能受到GNE-104的保护。为了进一步探索与激酶抑制剂或降解物治疗抗性相关的适应性转录程序，通过伪时间系统性排列治疗细胞，以无监督方式跟踪细胞状态演变，进行了轨迹推断分析。该分析确定了具有不同过程的四条路径（图2d-f）。激酶抑制剂敏感克隆与激酶抑制剂抗性克隆的分布表明路径b和c与激酶抑制剂抗性相关，而路径d代表敏感性。结果发现VIM表达沿着路径b和c升高，代表对EGFR抑制的普遍抵抗（图2f），而MAPK路径活性得分受到最强烈的抑制，G0/静止细胞状态沿着路径d升高，与敏感性一致。与激酶抑制剂抗性克隆的分布相反，降解物抗性克隆在路径a上最为普遍（图2e）。值得注意的是，与内质网途径中的蛋白质加工相关的基因沿着路径a下调（图2f），这表明内质网蛋白质加工基因的表达降低与EGFR降解剂处理下这些细胞的治疗适应和存活相关。事实上，与这些降解物抗性克隆中的GNE-104治疗相比，ER途径中的蛋白质加工是厄洛替尼治疗诱导的最丰富和最重要的途径（图2g）。

激酶抑制剂与降解剂治疗的明显区别在于EGFR蛋白的持续存在。尽管EGFR敲除单独导致EGFR蛋白大量丢失以及MAPK通路强烈抑制，但siRNA处理对PC9和HCC4006细胞的杀伤效果要差得多（图3a）。此外，经siEGFR处理的细胞对激酶抑制剂厄洛替尼和奥西米替尼的处理具有相反的作用（图3a）。这些结果进一步表明，EGFR蛋白水平的降低可能会阻碍EGFR激酶抑制剂的细胞功效。为了进一步验证这一假设，基于与VHL结合配体连接的变构EGFR配体EAI-045生成了EGFR降解剂GNE-641。根据分子模型和最近的一份研究，预计EAI-045将与奥西米替尼共同结合到EGFR L858R上。与模型预测一致，EGFR在与osimertinib和GNE-641共处理的细胞中被有效降解（图3b）。尽管GNE-641具有降解EGFR的能力，但其自身表现出非常温和的抗生长活性。然而，GNE-641与奥西米替尼的联合治疗促进了NCI-H1975和NCI-H3255细胞的存活（图3c）。综上所述，这些结果表明，EGFR蛋白本身在介导EGFR激酶抑制剂的完整细胞功效方面起着至关重要的作用。内质网蛋白稳定的破坏，如蛋白质错误折叠会增加内质网应激。当内质网应力超过某一阈值时，它通过ISR PERK–ATF4–CHOP axis34发出有效的生产信号。假设持续存在激酶抑制剂结合的EGFR蛋白可能导致内质网应激下游的前体信号级联激活，因此有助于细胞毒性。相反，EGFR降解物主动去除抑制剂结合的EGFR蛋白，从而最小化抑制剂结合的EGFR引起的应激（图3d）。结果发现erlotinib和osimertinib显著诱导PC9、HCC4006和HCC4006内质网应激下游关键产物ISR基因的表达（图3e，f）。此外，在通过siEGFR（图3e）或变构降解剂治疗（图3f）消耗EGFR蛋白产物后，这种诱导作用减弱。

为了进一步验证内质网应激在EGFR激酶抑制剂疗效中的作用，作者提出了以下问题：（1）阻断ATF4–CHOP信号的诱导是否会导致对EGFR激酶抑制剂的耐药性？（2）内质网应激的药理学诱导是否弥补了EGFR降解剂失去的功效？为了特异性地阻断内质网应激下游产生基因的过度激活，在添加EGFR激酶抑制剂之前，用ISR抑制剂ISRIB连续处理细胞24小时。ISRIB治疗确实减弱了EGFR激酶抑制剂诱导的ATF4、DDIT3和PPP1R15A的激活（图4b），并降低了PC9和NCI-H1975细胞的细胞杀伤（图4a，c）。相反，在极低无毒浓度下添加内质网应激诱导剂衣霉素或thapsigargin可显著诱导产生内质网应激基因的表达，并增强PC9细胞中降解物GNE-104的细胞毒性活性（图4d）。当与厄洛替尼或奥西美替尼联合应用时，PERK激活剂CCT020312进一步促进厄洛替尼和奥西美替尼诱导ISR基因表达，并增强细胞死亡诱导，导致EGFR抑制剂治疗后残余细胞几乎完全消除（图4e–g）。这些结果强调了一种以前未被认可的提高抗EGFR治疗反应的途径，可能具有临床意义。

总之，TraCe-seq平台能够通过追踪暴露于不同EGFR靶向治疗后有反应和持续存在的细胞，并进行差异基因分析和时间轨迹比较。这揭示了EGFR抑制剂反应的一个令人兴奋且以前未被认可的组成部分：由抑制剂结合的EGFR引起的内质网应激的诱导对于实现完全疗效至关重要。深入了解抑制剂结合EGFR和内质网应激诱导的生化机制有助于将来开发靶向EGFR和其他膜相关蛋白的小分子药物。此外，作者预计TraCe-seq方法将通过揭示预测对不同分子模式或治疗组合的反应和耐药性的未知特征来指导未来治疗的发展。

教授介绍

Xin Ye博士来自Genentech Inc.的高级研究员，为血管生物学和合成抗癌免疫领域的研究和早期开发工作提供科学和战略指导。研究领域包括许多人类疾病中的血管功能和功能障碍，包括肿瘤学、眼科学和炎症，以及癌症中血管内皮和免疫系统之间的相互作用。还担任Genentech研发部门的委员会成员。在Genentech研究部内外的血管生物学领域提供战略指导。监督多个进行的基础研究和药物发现研究。以通讯作者在相关杂志上发表论文多篇。

参考文献

hang, M.T., Shanahan, F., Nguyen, T.T.T. et al. Identifying transcriptionalprograms underlying cancer drug response with TraCe-seq. Nat Biotechnol (2021).https://doi.org/10.1038/s41587-021-01005-3