空间转录组测序技术追踪-第三期
在本期内容中，我们先借助Spatial Transcriptomics公司的原产品的Protocol详细了解一下技术的细节和要求。
空间转录组的大致流程为，首先，先对冻存组织进行OCT包埋，冷冻切片，取部分切片提取RNA进行质检，RIN值>7才能够达到后续的实验要求。样本RIN值合格后，即可进行后续的实验；正式实验中，包括组织优化Tissue Optimization（利用组织优化芯片）和正式的文库准备Library Preparation（LP芯片）先将切片粘附在组织优化芯片上，进行固定和H&E染色和显微镜的明场拍照，然后进行组织优化的后续实验步骤。组织优化流程是为了测试感兴趣的组织是否与空间转录组技术相兼容，并在整个空间转录组方案中优化给定组织的实验参数。
组织优化芯片结构如下：
组织优化芯片有6个亚区，8x8mm，每个反应区域为7.5x7.5mm，推荐用其中5个测试组织优化条件，1个用于阴性对照。阴性对照放置同样的组织切片，用其他试剂代替透化试剂处理；但是在预透化步骤仍然会产生弱信号，不过优化好的会产生比隐性对照强很多的信号。
组织优化的流程：
组织优化用的载玻片上有6个覆盖有RNA捕获探针的的正方形亚区。单个组织切片放置于每个亚区内，然后对组织进行甲醛固定、H&E染色、成像。然后加入透化试剂，使RNA从组织切片中释放出来，并与紧邻的RNA捕获探针杂交。设置一系列不同的透化条件能使用户确定感兴趣组织的最佳方案。随后利用荧光标记的核苷酸进行cDNA合成。最后，为了准确检测cDNA产生的荧光，组织必须被去除，组织去除步骤是优化的另一个关键点。
组织处理和切片注意事项：
•新鲜组织冻存于-80度，避免融化。
•如果冻存组织没有用OCT包埋，那么在切片之前需要进行OCT包埋。包埋之前需要将OCT预冷，使其变硬后包埋。
•组织切片大小最大为7.5mm x 7.5mm，与组织优化芯片相匹配，但是如果计划用相同的组织去做正式的实验，那么组织切片不能超过6.3mm x 6.7mm。
•组织+OCT需要10mm x 10mm见方（OCT会在固定和染色过程中被溶解和冲洗掉）。
•组织用冷冻切片机切片。
•先把TO芯片在冷冻切片机中预冷。
•推荐组织切片厚度为5-16μm；
•将组织切片放置在TO芯片上，确保放在玻片有效的表面上；（仔细放置组织切片，避免触碰到组织本身，可以触碰周围的OCT。将1个手指放在TO玻片的背面几秒钟，使玻片变暖，一旦目标区域玻片被温热后，组织会自动粘附到玻片上）；
•当组织切片放置在TO玻片上后，可-80度至多保存7天，或者可以直接开展实验。
明场成像注意事项：
•明场成像系统是为了捕获H&E染色的图像。
•为了在合理的时间范围内生成染色组织切片的高分辨率图像，我们建议低放大率，高数值孔径（NA）(e.g. 10x NA 0.45, 20x NA 0.5, 20x
•NA 0.75)，捕获的图像需要利用计算软件进行整合。
荧光扫描注意事项:
•采用微阵列扫描仪（如Innosca 710）能利用532nm激光有效激发荧光，建议分辨率为10μm/pixel。
•利用标准的荧光显微镜也能够捕获信号，但是需要broad Cy3/TRITC filter。(e.g. Chroma 49004; Zeiss 43HE)，高NA物镜(e.g. 20x NA 0.75)，以及更长的曝光时间。得到的荧光足迹就如H&E染色看到的形态，并且与背景是很容易好区分的。
组织移除注意事项：
•对于纤维少的、脂肪类的组织像脑，采用酶移除法 Proteinase K；
•对于纤维多组织，先采用化学试剂移除法β-mercaptoethanol ，再用酶移除法Proteinase K ；
*这里需要用TO实验中摸索出的处理条件。
*如果组织移除失败，组织还留在玻片上，那就要再做一个组织优化实验，增加或者更长时间的组织移除步骤。如果只有部分组织残留，你还可以试着去扫描玻片，然而，重要的是你要能区分很强的组织自身的发出的荧光型号和相对弱的cDNA足迹信号。
•该图是测试小鼠脑10μm切片组织优化透化条件的图。可以看到与阴性对照相比，透化会显著增强信号。该组织6分钟的透化处理能产生最强的cDNA荧光足迹。因此6分钟作为透化的最佳时间。
以上就是组织优化TO的主要内容，下面我们来介绍正式文库LP准备的方法。
•LP的玻片有6个亚区。每个亚区表面含有标签序列阵列点能够捕获mRNA，同时也作为反转录的引物。每个点中含有上百万个标签序列，并且每个点有独特的barcode，能够区分每个点。每个阵列含有1007个这样的点。
•组织切片放置在每个阵列上，固定，苏木精&伊红染色和拍照。接着，在细胞上加入透化试剂使mRNA从组织切片中释放出来，与玻片表面的标签杂交。然后进行cDNA合成。cDNA合成后，需要将组织从玻片表面移除（这是一个需要通过TO实验选择最优条件的关键步骤）。
•组织移除之后，表面标签/cDNA和结合的mRNA被从玻片表面切掉。每个阵列上的标签被搜集到不同的tube中。最后，切下来的标签用于准备测序文库。
推荐做5个组织切片，第6个亚区用作阳性对照。阳性对照是为了确保cDNA合成的是成功的。阳性对照不要放置组织切片，只需要用control RNA和cDNA master mix。RNA需要片段化成大约300bp。如果不想用阳性对照，也可以全部放置组织切片。
明场扫描：
荧光扫描：
荧光扫描的目的是为了准确比对H&E染色图像与空间转录组数据的每个阵列中的点。实验最后每个荧光点图像必须获得。这些荧光点会与明场图片中苏木精染色的点进行比对。
最后我们来看一下总体实验流程：
以上就是本期的全部内容了，spatial transcriptomics被10x Genomcis公司收购后，对整个实验流程和芯片都进行了非常大的优化，据说可以在1天内完成从获得切片开始到文库构建的全部流程，大大降低了实验过程的复杂度。下期将带大家了解优化后的芯片和实验流程~
「2019年10月29日 ·北京」
