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自从二代测序技术出现，把一次实验测许多条DNA序列的这个难题解决之后，一次把一个人的全基因组给测出来，最极限的情况，就是样本量就是少到一个细胞，就要测出整个基因组的序列信息。

三个难题

要实现从一个细胞样本测出全基因组的DNA序列，至少要克服以下3个难题：

• 第1个难题，就是如何实现均匀扩增，用传统的随机引物PCR的方法来扩增不同扩增片段的扩增效率多少会有一些差异，这些扩增效率的差异会随着扩增循环数的增加，呈现出指数放大的效果。其结果就是会发生严重的覆盖不均一，极少数区段的DNA被大量扩增，测序后它深度非常深，但在大多数区段只有很低的覆盖，甚至没有覆盖。那么我们就无法有效地判断那些低扩增效率区段的基因序列的情况。

• 第2个难题，就是 全基因组覆盖问题。常规的、用大量DNA进行建库的方法，因为打断、补平、加A、加接头等一长串的操作，每一步都会有DNA片段的损失。结果就是初始DNA中很大一部分会被浪费掉，而没有形成有效的文库分子。

在单细胞测序中，丢失大部分的起始DNA，是不可接受的。单细胞测序要求几乎所有的原始基因组片段都得到扩增，并且在后续的测序过程中被测序测到。这就要求几乎所有的片段，都会被得到扩增，而不只是少数片段得到有效扩增。

• 第3个难题，是这种方法要有较高的扩增效率。建好的文库，在HiSeq测序仪上机的时侯，大约每上机2万个文库分子，只有1个文库分子，是能够在测序的Flowcell表面生成簇，并且被测序测到的，剩下的大多数文库分子，在上机的时侯是被水冲走的。所以，单细胞基因组扩增的方法，还要有较高的扩增效率。至少要有上万倍到几十万倍的扩增效率，才能保证在全基因组测序的时侯，大部分的片段都被测序测到。

两种方法

为了解决上述的难题，科学家想了许多的办法。到目前为止，大家比较认可的方法有两种：第一种是MALBAC方法。第二种是MDA方法。

- MALBAC方法

我们先来说这个MALBAC方法。它的全称是：MultipleAnnealing and Looping-Based Amplification Cycles。是谢晓亮教授发明的方法

这张图是MALBAC方法的示意图。这个黑色的线条，就是基因组模板DNA，这些红颜色的线条就是扩增引物，扩增引物的5’端有27个碱基的通用序列，这些通用序列会作为未来的PCR通用扩增引物的结合序列。扩增引物的3’端有8个随机序列的碱基，这8个碱基可以随机地杂交到基因组DNA的互补序列上。

这些灰色的椭园是Phi 29 DNA聚合酶，Phi 29 DNA聚合酶有一个特点，它不仅可以生成新的DNA链，它还能把之前已经合成好的DNA链给解链开。

再形成自己的新链，这个特点能够把每个循环所能合成的DNA新链的数量提高几倍、甚至几十倍、上百倍。接下来，就是做5个MALBAC循环，请注意，这里每个循环的最后一步是58度退火。我们后面要详细解释这一步58度退火的作用。

第一个循环下来，得到的是一批5’端有通用扩增序列的DNA片段。

在第二个循环完成后，所产生的扩增产物中，大部分是5’端有通用序列。而3’端，有与通用序列互补的序列的这些片段。

图中的这4个步骤，一共重复5次，这样做的巧妙之处，就是要解决我们刚才所说的3个难题。

第一、是要均匀扩增
第二、是要全基因组覆盖
第三、是要有高的扩增效率

这个MALBAC方法的巧妙之处，就是在每个循环的最后，加了一步58度退火，这一退火过程，它让完整扩增的产物，它的两端发生链内杂交。这样，3’端的序列就不能与新的、游离的引物发生杂交。这也就不会引新的、发起始于3’端的扩增，这样，就避免了完整扩整的产物的自我指数扩增。

现在，还是8个随机序列的引物在模板上随机地找结合位置，所有的位点都有一样的机会被扩增。那么，这样实际得到的产物分2种：

• 第1种，就是m* n 个“完整扩增产物”，这是最主要的产物。这里“m”就是循环的次数， “n”是一个循环中，有多少个扩增，引物可以粘到一个模板上。

• 第2种扩增产物，就是(m+1)* n个“半扩增产物”，第3种DNA，就是那个原始的DNA模板，这里完整产物的数量是“m*n ”，也就是说，扩增产物（的数量）与扩增的循环次数“m”成正比，而不是与m的平方成正比。更不是与2 的M次方成正比。

这也就是达到了，我们想要的“线性扩增”的目的。也就是说扩增产物（的数量）与扩增的次数成线性关系。这就达成了我们单细胞测序当中第1个要求“线性扩增”。

再利用Phi 29聚合酶的能一次在模板上聚合出多个新链的功能来解决“全基因组覆盖”。

在5轮的扩增之后，每个模板都会有5*n^2个扩增片段。这样，就可以保证建库时大多数的基因组区域可以被建成文库，最后，可以被（测序）测到。

第3个要解决“高效率扩增”。还是利用了这个Phi 29酶的一次得到多个扩增片段的这个效果，来达成的。

上面所说的，就是MALBAC单细胞扩增技术的基本原理、和它的巧妙之处.

- MDA方法

目前市场上还有一种单细胞的扩增技术，叫MDA扩增技术。它的全称是MultipleDisplacement Amplification。MDA方法的技术核心是用Phi 29 DNA聚合酶来进行直接的扩增。

Phi 29酶的特点是，它可以把双链DNA进行解链，然后，在常温条件下，就把原始模板进行大量扩增。

- 两种方法的比较

把MDA和MALBAC两种方法进行比较

MDA的优势在于，它的扩增效率更高，并且，实验方法更简单。

MALBAC方法的特点，在于它的扩增均一性更好。但是，它得到的扩增DNA量相对较少，或者说，它的扩增效率相对比较低。

这张图是：大量细胞测序、MDA方法测序、MALBAC方法测序，这三种测序结果的Lorenz曲线。Lorenz曲线是越接近于对角线，则覆盖越均一，从图中，我们可以看出大量细胞测序，它的均一性是最好的。用MALBAC方法测序，它的均一性比大量细胞测序的均一性要差一些，但是要比MDA的方法的均一度要好。

这张图是用三种方法来测肿瘤细胞中的拷贝数变异。其中横轴是染色体的序列，纵轴是测序的覆盖深度，可以明显地看到，在大量细胞测序的结果中，可以非常直观地看到拷贝数变异的情况。

而用MALBAC的方法，也还是能够比较清楚地看到拷贝数变异。但是，它没有大量细胞测序的结果那么清楚。而用MDA的方法来看拷贝数变异，则不是那么容易看清楚。

- 临床应用

单细胞测序，有着广泛的应用前景。目前最主要2个应用：

• 1.是在胚胎植入前进行基因拷贝数变异检测。

• 2.是进行肿瘤的染色体变异研究。

在这里我们介绍一下，单细胞测序在胚胎植入前检测中的应用，在有习惯性流产的夫妇当中，最常见的病因就是染色体的平衡易位，所谓染色体平衡易位，也就是A染色体，的一段移到了B染色体上。

如果夫妻一方有染色体平衡易位，那么这对夫妇的受精卵中，每4个受精卵，可能只有1个是正常的。剩下3个（不正常的受精卵），很可能会流产。要把这一个正常的受精卵挑出来，目前，最有效的解决手段是做受精卵植入前检测。

那么具体的操作方法，就是先做人工受精。在受精卵发育到8个细胞的时侯，通过显微操作，抓一个细胞出来进行测序。在这个测序过程当中，就要用到MDA方法或MALBAC方法进行扩增、建库、测序。然后测序完成之后，挑出那个好的受精卵，植回到母亲的子宫中去。长成一个正常的新生儿。这个，就是受精卵植入前基因检测。这项技术，是对生殖健康有很大帮助的一项新技术。

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