文献摘要

非编码RNA已经显示调节多种恶性肿瘤的肿瘤进展的基因表达，以前的研究表明，大型肿瘤抑制激酶1（LATS1）在胃癌（GC）中起肿瘤抑制剂的作用，但是，非编码RNAs调节胃癌（GC）中LATS1表达的潜在分子机制尚未确定。作者通过TCGA RNA测序数据分析LATS1和has-miR-424-5p（miR-424）表达与GC患者的临床病理学特征和预后的相关性，通过circRNA表达谱和生物信息学分析，鉴定出新的环状RNA_LARP4（circLARP4）可以吸引miR-424，然后使用双荧光素酶测定法和RNA免疫沉淀（RIP）测定来证实miR-424与LATS1或circLARP4之间的结合位点。通过荧光原位杂交（FISH）技术检测circLARP4在GC组织中的表达和定位，进行MTT，克隆形成，Transwell和EdU测定来评估miR-424或circLARP4对细胞增殖和侵袭的影响。

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结果表明GC患者miR-424表达增加或LATS1表达降低与病理分期和预后不良有关。miR-424的异位表达通过靶向LATS1基因促进GC细胞的增殖和侵袭。此外，circLARP4主要定位于细胞质中，通过作为miR-424的海绵吸附体抑制GC细胞的生物学功能。circLARP4可能是GC中一种新的肿瘤抑制因子和潜在的生物标志物。

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为了说明circLARP4通过作为miR-424的海绵吸附体影响其对下游靶标基因LATS1 Mrna的翻译，作者分为两个方面进行说明：
（1）GC细胞中miR-424与LATS1 Mrna互作抑制LATS1的表达从而促进细胞的生长；（2）circLARP4对miR-424的吸附抑制细胞生长。下面我们就来看作者是如何来对主题进行说明的。

1、GC细胞的miR-424高表达并以LATS1 mRNA为靶标促进细胞生长和侵袭

（1）MiR-424-5p与GC中的LATS1表达呈负相关

作者在之前的研究中表明LATS1在GC的表达比对应的正常细胞中的含量很低，作者进一步通过使用癌症基因组图谱（TCGA）在人胃腺癌（GAC）组织（n = 387）和邻近的正常组织（n = 41）以及配对的GAC组织（n= 41）中验证了LATS1的低表达（下图a）。许多研究表明，miRNA通过抑制其靶基因的表达而在GC发育中起关键作用，作者推测LATS1可能受GC中的miRNA调控，于是利用StarBase v2.0，Pictar和miRanda软件预测了靶向LATS1基因3'-UTR的潜在miRNA，并鉴定了5个可以与非常高严紧度的LATS1基因3'UTR结合的miRNA，此外，作者研究了GAC中这些miRNA的表达水平，相关性分析显示，除has-miR-15b-5p之外，其他miRNA与LATS1表达呈负相关，其中miR-424-5p（miR-424） 与LATS1表达相关性最强（下图b1-b5）。

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（2）miR-424以LATS1 mRNA为靶标促进GC细胞的生长和侵袭

证实了miR-424与LATS1在GC组织中的表达呈负相关，那么LATS1是否是GC细胞中miR-424的靶基因呢？于是作者进行了下面的研究：首先利用mirPath v.3软件来验证miR-424是否与LATS1信号通路相关，结果是KEGG富集分析表明miR-424主要通过其中LATS1是核成员的Hippo信号传导途径富集；然后通过qRTPCR检测GC细胞系中miR-424和LATS1的表达水平，发现LATS1表达水平较低，而miR-424表达水平较高，与LESS1表达水平呈负相关（下图A）。miR-424 mimics（60μM）和miR-424 inhibit（80μM）分别转染miR-424低表达的HGC-27细胞和miR-424高表达的MKN-28细胞48小时后，qRT-PCR和Western印迹分析显示HGC-27细胞中miR-424的表达显着增加并且miR-424模拟物组中LATS1的表达降低（下图B和C）。荧光素酶实验表明HGC-27细胞中miR-424 mimics野生型LATS13'UTR的荧光素酶活性明显降低，而MKN-28细胞中miR-424 inhibit与NC组相比显着升高，突变型LATS1 3'UTR的荧光素酶活性在miR-424 mimics或inhibit与NC组之间没有差异（下图D）。说明miR-424以LATS1 3'UTR为靶标抑制蛋白的表达。

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2、circLARP4作为miR-424的海绵吸附体抑制肿瘤细胞生长

（1）circLARP4主要分布于肿瘤细胞质中影响细胞的生长和侵袭

越来越多的证据表明，circRNAs作为miRNAs的海绵吸附体的一种新型的ncRNAs，调节基因转录并与参与肿瘤发生的RBPs相互作用。为了鉴定在GC中作为miR-424海绵吸附体的的circRNA，作者应用circRNA表达谱和circBase和microRNA.org软件筛选出30个可以吸附并结合到miR-424的circRNA（下图a），通过限定条件这15个circRNA中只有circ_101057符合条件，作者将circ_101057命名为circLARP4。根据qRT-PCR分析，与线性LARP4相比，circLARP4对RNaseR核酸外切酶诱导的消化产生抗性，证明细胞中circLARP4环状结构的存在（下图c）。通过qRT-PCR分别检测细胞质和细胞核RNA分析显示，circLARP4大多数位于细胞质中（下图d）。 此外，作者利用FISH来检测circLARP4在GC组织细胞中的表达水平和定位，发现circLARP4在GC组织中的表达低于邻近正常组织（下图e）。

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（2）circLARP4作为miRNA的海绵吸附体抑制肿瘤细胞生长

由于circRNA可以作为miRNAs海绵，而circLARP4在细胞质中稳定分布，于是作者首先应用ComiR预测工具以及circLARP4基因组序列来预测得到可能与circLARP4结合的5种miRNA，然后用这5种miRNA进行荧光素酶检测，将pMIR-Luc-circLARP4的萤光素酶报道质粒与每种miRNA mimics共转染到HEK-293T细胞中，与阴性对照（NC）相比，miR-424将荧光素酶报道基因活性降低约75％（下图A），表明与其他4种miRNA相比，miR-424与circLARP4结合的可能性更大。miR-424inhibit增加野生型LATS13'UTR的荧光素酶活性，而对突变型LATS1 3'UTR的荧光素酶活性无影响（下图B）。此外，作者对细胞中的AGO2进行了RNA免疫沉淀（RIP），并通过qRT-PCR分析AGO2拉下来的内源性circLARP4和miR-424的表达水平，结果表明，Ago2抗体从细胞裂解物中沉淀出AGO2蛋白和大量的circLARP4和miR-424（下图C）。MTT实验分析circLARP4的表达减弱了HGC-27细胞中由miR-424引起的增殖作用，敲低circLARP4减弱了miR-424inhibit对MKN-28细胞的抗增殖作用（下图D）。这些结果说明了circLARP4能够作为miR-424的海绵吸附体，抑制其在GC细胞中对细胞增殖的促进作用。

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文献原文：Jing Zhang,Hui Liu,Lidan Hou,et al. Circular RNA_LARP4 inhibits cellproliferation and invasion of gastric cancer by sponging miR-424-5p and regulatingLATS1 expression[J].Molecular Cancer,2017, 16:151