ARMS PCR

ARMS-PCR

扩增阻滞突变系统PCR （Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR），又称为等位基因特异性PCR（Allele-Specific PCR，AS-PCR）。
ARMS-PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应。常规PCR扩增DNA所用的上、下游引物与靶序列完全匹配，而等位基因PCR采用等位基因特异的两条上游引物，两者在3’端核苷酸不同，一个对野生型等位基因特异，另一个对突变型等位基因特异，在Taq DNA聚合酶作用下，与模板不完全匹配的上游引物将不能退火，不能生成PCR产物，而与模板匹配的引物体系则可扩增出产物，通过凝胶电泳或者qPCR就能很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定SNP基因型，目前市场主流为ARMS+qPCR技术，采用TaqMan探针进行检测。（比如肿瘤靶向用药EGFR基因检测，CFDA批准的检测试剂盒，90%以上都是ARMS检测方法）简而言之：引物3’端错配的碱基会导致PCR引物延伸速度变慢，当错配达到一定程度时，引物延伸将终止，得不到特异长度的PCR扩增产物，从而提示模板DNA没有与引物3’端配对的碱基，反之则有。

ARMS-PCR（AS-PCR）检测原理

横向为针对W和M的两条上游引物，纵向为W和M的DNA Template，可以看出W引物只能特异性扩增W模板，M引物只能特异性扩增M模板。（在此基础上又延伸出四引物ARMS-PCR技术（Tetra-Primer ARMS-PCR）：同时使用4条PCR引物，两条3’末端位于SNP位点上的分属不同基因型的方向相反的内引物（inner Primer），两条位于SNP外侧并与SNP距离不等的外引物（outer Primer），4条引物理论上如果都匹配的话，两两组合可扩增出3条DNA产物（位于同一位点的两内引物无法产生长片段扩增产物，多为引物二聚体）。但若其中一条针对SNP的内引物不匹配，则只能扩增出另外两条DNA片段。由于外引物到达SNP距离不同，扩增产物大小也就不同，通过电影根据局扩增产物的大小即可判断基因型，同时由外侧引物扩增的长片段产物可作为体系的阳性质控）

ARMS+TaqMan qPCR

理论上Taq DNA聚合酶必须在引物3’末端碱基与模板完全互补情况下才能进行有效的聚合反应，但由于Taq DNA严谨性受多因素影响，某些情况下，即使引物的3’末端碱基与模板不互补，延伸仍然可以进行（如果3′末端只有一个碱基的错配，那么是引物是可以错配结合的并可以进行延伸的，只是延伸的效率低于那些3′末端正好配对的引物），而且不同的3’末端错位（mismatch）有不同的延伸效率（如果在3′末端引入了其他的错配碱基，那么错配的数目太多或达到一定程度，那么3′末端无法进行延伸），因而仅靠引物3’末端一个碱基的错配不能充分而可靠地区分两个等位基因，进而造成假阳性结果。
为了提高引物延伸的特异性，可在3’端倒数第2位或第3位碱基处引入一个错配碱基，该错配碱基与3’末端的错配碱基共同作用，使引物在与其3’末端不互补的模板中扩增产物率显著降低，而引物在与其3’末端互补的模板中正常扩增，引物的错配碱基类型取决于3’末端碱基错配类型。
注意：当3’末端是“强”错配（A/G或G/T）时，可以在引物中引入一个“弱”错配（C/A或C/T）；当3’末端是“弱”错配时，则需要在引物中引入一个“强错配”；当3’末端是出“中度”错配（A/A、C/C、G/G、T/T）时，可以在引物中再引入一个“中度”错配。一般在3’末端引入突变（倒数第3个碱基），可以显著提高特异性

引入错配碱基提高引物特异性

ARMS的特异性引物设计完成后，还需要一对等位基因特异性TaqMan探针，TaqMan探针5’端为荧光基团，3’端连有通用的荧光淬灭基团。在靶基因扩增过程中，PCR引物和荧光标记探针在退火时均会与目标序列互补结合（Probe Tm比较高，需在Primer 之前与DNA Template 结合）。Taq 酶在延伸模板链延伸时遇到与模板稳定结合的探针，Taq酶的5’-3’外切核酸酶会将与模板结合的特异性探针降解，从而使探针上的荧光基团因为物理空间分离，淬灭效应消失，发出荧光。如果荧光探针与目标序列存在错配，就会大大减少荧光的释放量。后续通过软件分析处理荧光数据而确定基因型。
TaqMan-MGB探针技术是在TaqMan法基础上优化而成的一个SNP检测方法（由普通Taqman探针和MGB基团两部分组成），该探针的3’端结合了小沟结合物（minor groove binder，MGB），MGB与DNA螺旋的小沟（minor groove）契合，通过稳定DNA双螺旋结构来提高杂交的准确性和稳定性。这使得探针长度进一步缩短，Tm值较高，增加了探针的杂交稳定性，使结果更准确。该探针结合的为非荧光淬灭基因，这可大大降低荧光本底，提高反应灵敏度。MGB探针设计应使SNP位点处于探针中间1/3范围内，尽量缩短MGB探针长度，但不少于13个碱基

ARMS-PCR优缺点

优点：

操作简单；
时间快速；
灵敏度高，可检测低至1%的突变；
只有一次开盖过程，有效防止污染；
整个操作只需Real-time PCR仪；
有大量成熟的商品化试剂盒提供；
成本较低（LDT）。

缺点：

通量较低；
不能检测未知突变；
不适于位点附近GC含量过高或过低的SNP的分型检测。

参考
1.基因Talks公众号：