Day7
- 今天学习的是测序的相关知识，以测序原理为主，为以后的生信实战奠定理论基础
第一代测序技术——Sanger
第一代测序
第二代测序技术——以illumina为例
第二代测序
第三代测序技术
第三代测序
附上文本
第一代测序技术——Sanger
- 原理：利用双脱氧核苷酸ddNTP来进行复制合成，而因ddNTP的3‘端没有羟基，不能进行延伸，就此终止，所以Sanger测序利用带有特殊荧光的ddNTP与dNTP一起复制，会产生许多长度不等的子代产物，其均有相同的5'端，利用DNA电泳，根据不同位置即不同荧光，便可读取DNA序列
- 特点：先合成后读取，通量小，准确度高，成本大
第二代测序技术——以illumina为例
- 第二代测序技术，又叫NGS（下一代测序技术），其以通量高为优点
- 原理：基础元件是flowcell流动池，其上有多条lane泳道，以增大通量，每条泳道上有许多tile，其上有测序所需的cluster簇，用于PCR扩增以及之后的荧光测序，而这些簇就是人工种的具有化学修饰的DNA引物，该引物与之后测序的接头序列相配对，且引物是以共价键与流动池相连的，在后续的冲洗中，不会被冲洗掉。
- 第一步：先用超声波等方式将DNA长链震碎，震成许多只有几百bp的短链，再用klenow酶在3'端加一个A碱基补成平末端，后在短链的两端接上与流动池上配对的接头序列，形成DNA混合物，即称为DNA文库。
- 第二步：桥式pcr，将DNA混合物接到流动池上（接头序列互补），再进行DNA复制形成双链，后用强碱打开双链，将合成链冲洗掉（剩下一条与流动池相连的簇链），加入中性液体中和碱液，因有两头的接头序列，簇链的另一端就可以和另一种引物互补，就可以再次复制合成双链，再加碱冲洗，如此重复多次，DNA的数量会以指数增长，后将一个引物上的特定基团切断，使其一端与流动池连接，再用碱冲洗单链，就可以得到许多与流动池连接的DNA单链。
- 第三步，测序，加入测序引物，和带荧光标记的dNTP，且dNTP的3'端被一个叠氮基所堵塞，导致DNA复制不能进行，一次循环延长一个碱基，机器读取荧光，再通过化学反应将叠氮基去掉，就可以连接下一个dNTP，如此重复，可以得到许多短的单链DNA序列。
- 第四步，读取index(barcode)，先用碱将测序合成的单链冲洗掉，再加入另一种测序引物，该引物位点在index旁，测序后就可以知道该单链来自哪个原始样本
- 附，双端测序，两端都可以连接引物进行测序，使测序有效长度增加了一倍，即将一端引物切掉后，该种簇会断掉，继而进行另一种引物的测序工作即可
-特点：边合成边测序，通量大，成本低，但样本准备较繁琐
第三代测序技术
①SMRT单分子测序
- 原理：以SMAT芯片上的零模波导纳米孔（ZMW）为核心元件，ZMW是直径只有几十纳米的小孔，激光波长更大，无法穿过，会形成衍射，在ZMW中利用带荧光的dNTP进行合成，读取荧光信号测序
- 特点：边合成边测序，不用进行PCR扩增，所需时间较短
②Oxford Nanopore 纳米孔单分子通道技术
- 原理：其利用仅允许单个碱基通过的蛋白纳米管道，在膜两侧施加电压，通过检测不同碱基在通过时所产生的微小的电流和电压影响来判断碱基类型
- 特点：检测的是电信号而非荧光信号，适合单分子测序
请原谅我没有配图，我是真的懒
