实验设计
实验目的决定试验方法和途径。
试验目的 :获取三阴性乳腺癌的正常组织和癌症组织的基因表达差异情况，比较三阴性乳腺癌中的基因表达变化情况。
试验设计 :通过TCGA获取乳腺癌的RNA-seq表达数据，筛选出三阴性乳腺癌的样本，通过比较癌症和正常组织的表达差异。
TCGA数据库简介
一句话介绍:TCGA数据库是一个由国家癌症研究所(National Cancer Institute)和美国人类基因组研究所(National Human Genome Research Institute)共同监督的一个项目。使用对患者样本的高通量基因组测序和分析技术来试图提供括基因表达谱，拷贝数变异分析，SNP基因分型，全基因组DNA甲基化分析，微RNA分析等信息。收录了33种癌症基因组测序数据。TCGA数据处理和整理比Oncoman和GEO困难一些。但是针对肿瘤和癌症所能提供的信息是很完善和可靠的。
TCGA和GEO存在的区别是，GEO存在各种研究领域和研究方向的NGC数据和分析。TCGA是专门针对肿瘤和癌症设立的。TCGA优势是丰富且规范的临床数据，以及针对每种癌型的大样本量。
TCGA数据的获取
背景介绍：
三阴性乳腺癌是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和原癌基因Her-2均为阴性的乳腺癌。这类乳腺癌占所有乳腺癌病理类型的10.0%～20.8%，具有特殊的生物学行为和临床病理特征，预后较其他类型差。--from:百度百科:三阴性乳腺癌
实验设计：
三阴性乳腺癌的筛选标准是根据pheotype来确定的，表达量是通过RNAseq结果确定的，正常组织和癌症组织是通过病例号确定的。
- TCGA项目的数据可以通过Genomic Data Commons Data Portal获取，即通过GDC来访问，访问地址：https://portal.gdc.cancer.gov/。
- TCGA数据库公开免费，所以有许多针对TCGA数据进行整合的网站。还可以通过UCSC Xena进行下载：https://xena.ucsc.edu/public。试验数据的选择和目的息息相关，试验设计：
GDC
点击BRCA（乳腺癌）进入数据选择界面。 - 选择
gene expression RNAseq>HTSeq - Counts。注意不要用RPKM等经过了normlization的表达矩阵来分析。要使用Counts来进行差异分析，因为在差异分析时候会自动进行标准化。如果数据经过处理例如log2+1，则可以下载后逆运算转变回来。 - 选择
phenotype>Phenotype这里面有病人的病例信息等，可以通过统计筛选出三阴性乳腺癌的患者。
BRCA -
点击连接进去会看到详细的信息如下载地址、样品数、数据处理方法等。
RNAseq界面详细信息
数据预处理
实验设计：筛选出三阴性乳腺癌的患者ID，再筛选出同时有癌症组织样本和癌旁组织样本，计算初始Count值。
三阴性乳腺癌患者（TNBC）筛选
实验设计：在R语言中处理数据，选择breast_carcinoma_estrogen_receptor_status（ER）、PR、HER2受体一栏全为隐形（Negative）的患者。
原始的phenotype文件如下图，信息量巨大
R语言实现：
读取文件
phenotype_file <- read.table("TCGA-BRCA.GDC_phenotype.tsv",header = T, sep = '\t', quote = "")
phenotype_colnames <- as.data.frame(colnames(phenotype_file))
#读取文件并去读列名（penotype的类型）
table(phenotype_file$breast_carcinoma_estrogen_receptor_status)
#查看雌激素受体(ER)的表达状态。
table(phenotype_file$breast_carcinoma_progesterone_receptor_status)
#查看孕激素受体（PR）状态
table(phenotype_file$lab_proc_her2_neu_immunohistochemistry_receptor_status)
#查看原癌基因Her-2状态
列出三项指标的列表，方便筛选
实验设计：查找三项指标的列并列出
colnames_num <- grep("receptor_status",colnames(phenotype_file))
#在phenotype_file列中检索“receptor_status”,grep返回值是列名的列表中包含有“receptor_status”的列序号，因为三阴性乳腺癌的三项指标在这里都有phenotype_file字段
#>colnames_num
#[1] 20 25 67 77 87 93
phenotype_colnames <- colnames(phenotype_file)[colname_num]
#利用匹配的返回值取列名到phenotype_colnames中,phenotype_colnames中存储的是含有“receptor_status”字段的列名
eph <- phenotype_file[,colnames_num[1:3]]
#把三项指标筛选出来，建立一个新的表格。方便筛选全阴的行（ID号）
函数学习：
?apply
# b为：
# first second
# one 1 4
# two 2 5
# three 3 6
# apply(b,1,sum)
# 上面的指令代表对矩阵b进行行计算，分别对每一行进行求和。函数涉及了三个参数：
# 第一个参数是指要参与计算的矩阵；
# 第二个参数是指按行计算还是按列计算，1——表示按行计算，2——按列计算；
# 第三个参数是指具体的运算参数。
# 上述指令的返回结果为：
# one two three
# 5 7 9
TNBC的筛选
实验设计：查找指标的状态并统计；列出三阴性并筛选出来这些数据
tnbc_rownum <- apply(eph,1,function(x)sum(x=="Negative"))
#eph：记录三项指标类型的矩阵
#将eph按照列执行sum(x=="Negative"):统计各行中，eph列中有Negative的数量
#通过查看阴性的数量，函数返回结果是一个数字向量。内容是0或1、2、3。注意数字的排列顺序是对应病人ID的行。
tnbc_rownum
tnbc_sample <- phenotype_file[tnbc_rownum == 3, 1]
#通过让 tnbc_rownum==3 判别，如果成立，会返回一个logical向量，logical向量是可以直接被矩阵引用的，只会读取TURE的行或着列
#统计每一行中数值是3的（即全为“Negative”）并取第一列即病人ID
#tnbc_sample：存储着三阴性乳腺癌的
tnbc_sample
save(tnbc_sample,file = 'tnbc_sample.Rdata')
#保存Rdata
基因表达矩阵的构建
基因表达矩阵的读取和读取后格式修改
实验设计：转换data.frame ；行名修改；Count值还原
library(data.table)
#?data.table
#R中的data.table包提供了一个data.frame的高级版本，让你的程序做数据整型的运算速度大大的增加。
a <- fread("TCGA-BRCA.htseq_counts.tsv.gz",sep = '\t',header = T)
#读取表达矩阵文件
a <- as.data.frame(a)
#转换为数据框，读取后，转换前的a的类型是"data.table" "data.frame"
a[1:4,1:4]
rownames(a) <- a[,1]
a <- a[,-1]
#去除第一列，行名修改。
genes <- row.names(a)
genes[1:10]
##接下来还原counts数，网站使用了log2(count+1)进行counts数转换，接下来进行还原
a <- a^2-1
#a存储的全是数值型向量，可以直接通过数学处理进行全表修改。
对表达矩阵进行筛选构建
实验设计：列出TNBC的ID（前半部分），所有病人ID，有双样品类型的seq的病人ID，取TNBC的ID和双样品类型的seq病人ID交集作为目的病人ID。最后用 all_p %in% need_p 构建logical向量，被原始表达矩阵引用，构建符合目的要求的表达矩阵
##接下来是取样本，需要取118个三阴性乳腺癌的样本，并且是成对的样本，即既有癌组织又有癌旁组织。
tnbc_p <- substring(tnbc_sample,1,12)
#取tnbc的每个元素的第一个到第12个字符
#tnbc是TNBC患者的ID前部分
all_p <- substring(colnames(a),1,12)
head(all_p)
#取表达矩阵的病理号前12位
table(all_p)
#这里如果病人号前12位相同，说明是即既有癌组织又有癌旁组织。
table(all_p) == 2
paired_p <- names(table(all_p)[table(all_p) == 2])
#去除所有有两个组织类型的病人ID前部分赋值给paired_id
need_p <- intersect(tnbc_p,paired_p)
#need_p是118个是成对的样本。即既有癌组织又有癌旁组织
exprSet <- a[,all_p %in% need_p]
#构建表达矩阵：三阴性乳腺癌的样本，并且是成对的样本，即既有癌组织又有癌旁组织
#这里通过 all_p %in% need_p 处理返回一个 logical向量，logical和第一个数据元素all_p一一对应，元素个数和顺序和all_P相同。向量可以在在data.frame中引用，只会读取 TRUE
对构建的表达矩阵进行数据筛选
实验设计：利用apply函数统计条件符合情况，然后保存为logical向量，然后利用logical的被引用来筛选
table(apply(exprSet, 1, function(x){sum(x==0)<10}))
tmp <- apply(exprSet, 1, function(x){sum(x==0)<10})
#对exprSet进行按行执行函数function：
#如果表达矩阵是0则取1，在18个样本中，如果这个基因的表达矩阵超过10个样本都是空值，则舍弃这个基因
#tmp是一个logical向量
exprSet <- exprSet[tmp,]
save(exprSet,file = 'tnbc_paired_exprSet.Rdata')
#保存三阴性乳腺癌的双样本表达矩阵
癌症组织和正常组织的区分和标记
实验设计：利用substr()函数截取患者ID的有效信息位置，用ifelse()函数进行判断，并用factor()函数生成因子型变量。最后赋值得到患者的样品类型
Tips：TCGA可以根据第14和第15位判断是癌组织还是癌旁组织。01表示癌症组织，11表示正常组织
#TCGA可以根据第14和第15位判断是癌组织还是癌旁组织。01表示癌症组织，11表示正常组织
colnames(exprSet)
#提取列名
substr(colnames(exprSet),14,15)
#提取列名字符串的第14和15位置字符
as.numeric(substr(colnames(exprSet),14,15))
#现在提取的字符变成数字 '11'和 11不等同
ifelse(as.numeric(substr(colnames(exprSet),14,15)) < 10,'tumor','normal')
#判断第14和15号位的数值<10 即等于01时候，返回tumor 否则返回normal
factor(ifelse(as.numeric(substr(colnames(exprSet),14,15)) < 10,'tumor','normal'))
#question 把它变成因子型，因子型是有顺序的。这里需要变换成因子型
group_list=factor(ifelse(as.numeric(substr(colnames(exprSet),14,15)) < 10,'tumor','normal'))
#group_list记录了表达矩阵中患者ID的对应的组织类型，和表达矩阵的顺序一样。
table(group_list)
表达矩阵的筛选（应该在上一步一起进行）
实验设计：修正小于0的（因为变换过程中可能会产生-1，会影响实验），检查并去除na值。
exprSet <- ceiling(exprSet)
#?ceiling（）取整，不小于变量本身
#round()以四舍五入形式保存指定小数位数
#floor()不大于变量本身最大整数
#table(is.na(exprSet))
#pmax(),使得矩阵最小值是0？
save <- exprSet
exprSet[exprSet<0] <- 0
table(exprSet<0)
table(is.na(exprSet))
患者的癌症组织和正常组织的基因差异表达分析
library(DESeq2)
#构建一个病例号和肿瘤分类的对应关系
colData <- data.frame(row.names = colnames(exprSet),group_list= group_list)
#colData:是患者ID号和组织类型的对应关系
#构建DESeq()函数要求的表达式
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,colData = colData,design = ~ group_list)
#countData = exprSet,指出DESeq的表达矩阵
#colData = colData,知名每个表达矩阵的分类，比如实验组&对照组，正常组织&癌症组织
#question
#design= ~group_list，因子型，指出不同组的区别，是有顺序的。
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,
colData = colData,
design = ~group_list)
dds <- DESeq(dds)
#进行差异基因分析
resultsNames(dds)
res <- results(dds, contrast=c("group_list","tumor","normal"))
#用group_list来做引导文件，用tumor来比较normal组织
resOrdered <- res[order(res$padj),]
#把res差异分析文件通过padj来排序
head(resOrdered)
resOrdered=as.data.frame(resOrdered)
#把resOrdered变成数据框，
write.table(resOrdered, file="single cell DGE order.xls", sep="\t",quote=F)
#写出差异基因文件
基因的注释
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