前几天的CVR (23.2.2)

活化的CD4+ T细胞介导自身免疫性心肌炎发病，其中Th17细胞是最主要的致病细胞。Th17细胞分泌例如IL-17A、IL-17F等细胞因子，促进病毒复制、炎症细胞浸润、抗心肌自身抗体分泌和心肌纤维化。在T细胞受体被刺激后，幼稚的T细胞进行糖酵解代谢重编程，促进T细胞的激活、增殖、分化和迁移。Th17细胞分化依赖糖酵解满足其高能量和生物合成需求，而Treg则优先依赖氧化磷酸化和脂肪酸氧化。
磷酸甘油酸激酶1(PGK1)是糖酵解途径中必不可少的酶，可催化磷酸基团从1,3-BPG转移到ADP，以产生3-PG和ATP，是糖酵解途径中第一个ATP生成步骤。过去报道PGK1通过介导糖酵解来促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。然而，PGK1是否通过糖酵解调控CD4+ T细胞从而介导心肌炎的发病尚不清楚。

1. The expression of PGK1 is increased in T cells and Th17 cells during myocarditis

Fig 1A-C：作者对此前发表的自免心肌炎单细胞数据进行重分析，发现Th17细胞富集到了glycolytic process pathways，且特异性的表达Aldoa, Eno1, Ldha, Pgk1, Tpi1等glycolytic genes。
Fig 1D-E：作者主要关注了PGK1 (磷酸甘油酸激酶1,the first ATP-producing enzyme in the glycolytic pathway)，这个基因在Th17细胞中显著比其他T细胞高，在EAM组织中也是高的。
Fig 1F-G：对EAM小鼠和心肌炎患者心脏的免疫组化染色也显示PGK1的高表达。
Fig 1H-J：免疫荧光染色也提示PGK1和CD4及IL-17A存在共定位。

Fig 1

复习一下

2. PGK1 inhibition reduces the severity of EAM

为了明确PGK1在心肌炎中的作用，作者首先使用了PGK1抑制剂NG52 (100 mg/kg/day)干预小鼠，在21天收取组织。结果显示治疗后小鼠心脏体重比下降，炎症浸润情况和纤维化情况均减轻，心功能也出现改善。

Fig 2

3. PGK1 inhibition regulated cardiac CD4+ T cells infiltration

PGK1抑制剂治疗显著降低了自免心肌炎小鼠心脏中的Cd4⁺ Th细胞和Il17A⁺ Th17细胞的比例，对Foxp3⁺Treg细胞则影响不大。
除此之外PGK1抑制剂治疗组的Cd8⁺ T细胞、产IFN-γ 和 GZMB的Cd8⁺ T细胞以及促炎性Ly6C^highCD11b⁺单核细胞数量也下降（附件）

Fig 3

The above results suggest that NG52 reduced the infiltration of cardiac CD4+ T subsets and other immune cells, and suppressed the expression of pro-inflammatory cytokines.

4. PGK1 regulates CD4 T cell maturation and Th17 responses in the periphery

由于Cd4⁺ T细胞在外周血中（进入心脏前）就成熟了，因此作者进一步探究了NG52是否影响了外周血CD4⁺ T 和 Th17细胞的development。
Fig 3D：NG52组外周血的CD4⁺Tn (CD44^-CD62L⁺)有增加的趋势， 效应CD4⁺T (CD44⁺CD62L^-) 则有下降趋势（统计学无意义）
Fig 3E-F：NG52治疗后，外周血Th17细胞下降，Treg细胞上升。
外周血Ly6C^highCD11b⁺单核细胞和 Ly6G⁺CD11b⁺中性粒细胞比例也下降（附件）。

Fig 3

This suggests that PGK1 inhibition prevents the maturation and development of CD4⁺ T cells, Th17 cells, and myeloid cells in the periphery, while promoting the formation of Treg cells.

5. PGK1 regulates CD4+ T cell activation and Th17 cell differentiation in vitro

为了探究PGK1对pathogenic CD4⁺ T细胞活化的直接作用，作者从EAM小鼠分离了CD4⁺ T细胞，给予了CD3/CD28抗体刺激，同时给了NG53治疗。
Fig 4A-B：NG53治疗显著降低了CD4⁺ T细胞CD25的表达(A)，抑制了CD4⁺ T细胞的增殖(B)。提示PGK1 directly mediates the activation of pathogenic CD4⁺ T cells。

细胞增殖检测：CSFE

Fig 4C：QPCR结果显示PGK1治疗后Th17相关基因如Il17a, Il17f, 和 Il23r表达显著下降，提示PGK1可能更主要调控Th17反应。

Fig 4D：为了进一步探究PGK1对Th17分化的作用，作者在Th17-polarizing cytokines存在的情况下对Tn细胞进行了NG52干预，发现NG52干预下，Tn细胞向Treg分化增加，向Th17分化减少。
Fig 5E：QPCR的结果也提示NG52干预降低了Th17相关基因如Il17a, Il17f 和 Il23r的表达，Il21, Il22 和 Csf2 则没有显著变化。
Fig 4F：在调控Th17分化发育的转录因子中，NG52干预特异性的影响了Rora和Ahr。其他转录因子如Rorc, Batf, Irf4则未受影响。
此外，Treg分化相关基因出现上调，提示NG52可以影响Th17/Treg平衡。

肿瘤微环境中的Th17/Treg平衡

6. PGK1 regulates the glycolytic metabolism of Th17 cells

随后作者想要去进一步探究PGK1调控Th17细胞分化的机制。PGK1是糖酵解途径的关键酶。糖酵解在Th17分化发育中起到重要作用，因此作者推测NG52可以通过limiting the engagement of glycolysis来调节Th17细胞分化。因此作者分析了NG52对Th17细胞glycolytic capacity的影响。
Fig 5A：fluorescent-glucose analogue uptake assay提示NG52治疗的Th17细胞，葡萄糖摄取下降。
Fig 5B：QPCR的结果也显示NG52显著阻断了多种 glycolytic genes 如Aldoa, Pkm, Pgk1, Lhda和Gapdh的表达。
Fig 5C：Seahorse结果也显示NG52显著降低了Th17的糖酵解，accompanied by a relative increase in the mitochondrial respiration ratio。

7. PGK1 regulates ROS generation in Th17 cells through PDHK1 phosphorylation

PGK1除了是糖酵解途径的关键酶，还是PDHK1活化的激酶。它可以降低丙酮酸进入三羧酸循环，因此降低线粒体ROS产生。此前有研究显示抑制PDHK1可以通过促进ROS产生抑制Th17分化，因此作者推测PGK1的抑制可以增加ROS的累积，过量的ROS可以抑制Th17的分化。
Fig 5D：首先作者探究了在Th17分化过程中PGK1是否可以磷酸化PDDHK1。免疫荧光显示在Th17细胞中PGK1与PDHK1存在共定位。
Fig 5E：NG52治疗降低了PDHK Thr338位点的磷酸化，而PDHK1蛋白表达则没有受影响。p-PDHK1/PDHK1同样降低。提示PGK1确实引起了PDHK1的磷酸化。
Fig 5F：随后作者检测了NG52对Th17细胞ROS水平的影响。DCFDA染色发现给予NG52治疗的Th17细胞，ROS水平更高。MitoSOX染色（线粒体ROS指标）也发现NG52治疗提高了Th17线粒体ROS水平。
Fig 5G：最后作者同时给予了Th17细胞ROS scavenger NAC 和 NG52，发现NAC治疗恢复了被NG52抑制的Th17分化。

8. PGK1 inhibition prevents progression of myocarditis to DCM

随后作者探究了NG52治疗是否可以阻断心肌炎向扩心病的进展。因此作者在EAM小鼠造模后给予NG52治疗到day 21，在day 42收小鼠。结果显示小鼠心脏体重比下降，纤维化减轻，心功能改善。

9. PGK1 regulates CD4+ T cell activation and Th17 cell differentiation in myocarditis patients

最后作者在患者样本上做了一下验证。
作者首先分离了心肌炎患者外周血单个核细胞。
Fig 7A, B：免疫荧光显示PGK1与CD4和IL-17A共定位。
Fig 7C, D：随后作者分离了心肌炎患者外周血CD4T细胞。NG52治疗降低了T细胞活化marker HLA-DR的表达。同时，细胞增殖也出现下降。
Fig 7E：最重要的是，PGK1抑制在Th17 polarization conditions下依然阻断了Th17分化。

Overall, these results suggest that the modulation of PGK1 might represent a valuable approach to limit CD4⁺ T and Th17 cells activation in myocarditis patients.

综上所述，该研究发现，PGK1通过调节糖酵解和PDHK1-ROS轴来充当Th17细胞分化的关键代谢调节剂，促进心肌炎的炎症浸润和心肌损伤。该研究揭示了PGK1在心肌炎中的重要作用，为心肌炎的治疗提供新的思路与潜在靶点。