Single cell transcriptomic analysis of human mesenchymal stem cells reveals limited heterogeneity

人脐带间充质干细胞单细胞转录组文章，探索人脐带间充质干细胞的异质性，文章链接：Cell Death and Disease

Abstract

间充质干细胞（MSC）是一群多能细胞，具有通过调节再生和炎症优异的促进组织修复能力。MSCs在疾病治疗中的疗效依赖于产生的同源性细胞群体的相对数量。但是，体外扩增培养的MSCs的细胞异质性和分化的轨迹（方向）尚未阐明。文章分析了来源于两个脐带（UC-MSCs）的361个MSCs单细胞转录组。对这些收获于不同时期的UC-MSCs采用炎症因子刺激或者不刺激。通过加权基因相关网络分析意外发现UC-MSCs仅仅拥有有限的异质性且与供体和细胞代际无关。同时，还发现用炎性细胞因子（IFNγ和TNFα）预处理后，这种经典的策略可以提高MSCs的治疗效果，并且处理后MSCs的基因表达出现一致性的变化。基于细胞周期依赖的主成分分析显示，鉴定出具有有限异质性的这些UC-MSC与它们进入G2 / M期密切相关。并观察到特异性基因CD168以细胞周期依赖性方式表达。CD168阳性的细胞体外分选和培养时，CD168的表达依然显示出对周期的依赖。研究结果表明，体外扩增的UC-MSCs是一群具有以细胞周期为主的有限异质性的细胞。因此，本研究为基于MSCs的疾病治疗提供了标准化的信息。

Introduction

间充质干细胞（MSCs）是由俄罗斯科学家Alexander Friedenstein在20世纪60年代后期从骨髓（BM）中发现的多能细胞，他观察到骨髓是生物体出生后间充质组织的干细胞库¹。如今，MSCs的鉴定基于它们的成纤维细胞样形态，一系列的表面标志物表达状态及其三系分化潜能²。由于MSCs的自我更新特性和多重分化潜能，体外扩增MSCs在再生医疗中具有广阔的前景。
(人们)已经可以从各种组织和器官中分离出来MSCs，尽管骨髓来源的MSCs最广泛地用于潜在的治疗探索，脐带来源的UC-MSCs似乎更适合于临床应用。与BM-MSCs相比，UC-MSCs更易于大量获取，省去了骨髓穿刺的麻烦。重要的是,UC-MSCs源于生命的早期阶段，并且在体内移植中，具有较低的免疫原性。尽管UC-MSCs主要用于异体移植治疗，但是它们的治疗效果已经在一些临床前和临床研究中得到了证实^3,4。
在过去十几年中，由于MSCs的棉衣调节能力，显示出MSCs在组织再生的临床应用与管控炎症性疾病中取得了令人瞩目的成就。MSCs在治疗炎症性疾病具有惊人的效果，首先发现于一名患有类固醇和环孢菌素抗性GvHD5的9岁患者⁵；然而，这一治疗效果并不使总能复现⁶。考虑到炎症在调动MSCs免疫抑制能力关键作用，一系列的临床治疗采用联合IFNγ and TNFα炎性细胞因子来体外预处理MSCs，从而改善了MSCs在自身免疫性疾病的治疗效果^7,8。MSCs精确表达的诸如CCL5，CXCL9，吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO），前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）趋化因子和免疫抑制因子。TSG6能被炎症细胞因子诱导并通过协同作用导致免疫抑制⁹。

在限制MSCs在临床应用中的疗效的突出因素中，MSCs群体的标准化被归于首位。依据文献报道，MSCs在体外扩增中存在形态和增殖速率方面存在差异¹⁰ 。此外，来自不同克隆的MSCs展现出不同的克隆集落形成和分化能力¹¹。这些证据表明，来自不同供体，组织，克隆甚至来自同一克隆集落的不同细胞的MSCs可能存在异质性¹²。

在对迟发型超敏反应（DTH）的小鼠模型先前的研究中，发现从不同供体分离的MSC对治疗DTH13显示出明显的疗效差异¹³。因此，克隆间异质性可能是临床试验结果不一致解释。单细胞测序的进步为探索单细胞水平的细胞异质性提供了一种独特的方法。迄今为止，关于人类MSCs的大多数研究都是基于混合群体，迫切需要对MSC的单细胞分析进行详细研究，以阐明各种特性的变化。

本研究中，我们采用了最新的微流体单细胞捕获系统和高通量测序技术研究人UC-MSCs的转录组学的异质性。我们分析了361个UC-MSCs。其中的159个暴露与炎性细胞因子中。研究发现，培养的UC-MSCs存在细胞亚群。基于加权基因相关网络分析（WGCNA）^14,15，发现UC-MSCs的异质性由某些关键基因模块所决定。通过对这些基因的进一步分析发现，细胞周期分布是UC-MSC中异质性来源的重要原因。结合其他一些研究的信息，我们的结果表明UC-MSCs是一群相对同源的细胞群，并且分离和扩增方案中的标准化具有较高的可能获得更好的临床疗效。

Results

Heterogeneity in human umbilical cord derived MSCs（脐带来源的MSCs的异质性）

单细胞转录组分析已经被广泛用于识别细胞信号和揭示细胞发育轨迹。为了检测MSCs的异质性增加它们在临床上的应用。我们从脐带中分离MSCs，体外扩增培养，采用单细胞转录组测序 (Fig. 1a）。这些体外扩增培养的UC-MSCs满足MSCs的定义要求，CD73, CD90, CD105的细胞表面标记呈阳性，CD31，CD34，CD45和HLA-DR的呈阴性。(Fig. S1).

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我们基于Fluidigm C1自动制备系统和96×96集成流体回路，分离得到单个的UC-MSCs（52个来自供体1的第5代细胞，50个细胞来自供体2的第0代细胞，50个细胞来自供体2的第2代细胞，50个细胞来自供体2的第5代细胞）(Fig. 1b) 。经过RNA提取，cDNA预扩增和测序质量控制后，我们制备了所有的361个细的cDNA文库（159个细胞和202个没有刺激的细胞），利用Illumina HiSeq 2500系统对这些细胞进行转录组测序。并在高灵敏度DNA测定中证明了其高度均一性(Fig. S2)。

通过对单细胞转录组数据分析，202个未处理细胞使用外加标1,4,7的RNA或ERCC作为内参，识别 出高度可变的基因，并通过主成分分析，在所有的四个数据集中发现了（huc2_p0， huc2_p2，huc2_p5，huc1_p5）几个亚群(Fig. 1c)。
在被检测的基因中，经过低表达基因过滤(在至少1/10细胞中检测到，每个细胞平均1个读数）54​​98个基因中的4753个被保留，这些基因所在的数据集被用于WGCNA分析。结果显示，对于原代UC-MSCs,the blue module (蓝色模块)（0.79，huc2_p0中p = 1×10-11）和 the turquoise module(绿松石模块)（0.95，huc2_p0中p = 2×10-26）与huc2_p0亚群中的第3组和第2组显著相关(Fig. 1d)。在第四个数据集中发现了类似的结果(Fig. S3). 。Venn图显示四个数据集中的蓝色模块和绿松石模块共享基因Fig. S4)。 Z得分（Z-summary score）表明（蓝色：huc1_p5：15.43，huc2_p2：15.67，huc2_p5：9.47;绿松石：huc1：43.73，huc2_p2：46.63，huc2_p5：32.19）的基因是高度保守的 (Fig. 1e)。这些结果表明，人类UC-MSC中存在亚群，并且这些亚群保守而不依赖于供体和传代。
为了找到不同MSCs亚群的特征标记，我们扫描了蓝色模块和绿松石模块中的，那些在一个特定组中高表达的基因，并存在至少一个数据集中 (Fig. S5, group 3 in dataset huc1, group 2 in dataset huc2_P0, group 3 in dataset huc2_P2, and group 4 in dataset huc2_P5). 随后识别出七个特征基因：brca1，cdca5，hmgb1，hmmr / cd168，melk，prc1和racgap1。它们在四个子集中的表达模式相似，选取huc2_p0作为代表 (Fig. 1f 和
Fig. S5). 与其他组相比，这7个基因在第2组中的表达显著升高。总之，我们发现UC-MSCs在某些基因的表达时具有异质性。

Inflammatory cytokines stimulated MSCs subpopulations also exhibit heterogeneity in the featured genes 炎性细胞因子刺激的MSCs亚群也在特征基因中表现出异质性

MSCs最独特的特征之一，是它们的免疫抑制功能和治疗各种炎性疾病的有效性。如今关注的问题是在MSCs细胞中炎症诱导的基因表达是否存在异质性。在用IFNγ和TNFα刺激后，分析了159个UC-MSCs细胞huc1_sti_p5，huc2_sti_p2和huc2_sti_p5）(Figs 1a and 2a)。通过无偏的层次聚类，在所有的数据集中识别出了一个明显的亚群(Fig. 2b and Fig. S6)。WGCNA分析显示，绿松石和蓝色模块在不同的数据集中具有显著的相关性和保守性。另外，这两个模块中大量的基因与未处理组中的基因相似(Fig. 2c, d and Fig. S7)。有趣的是，在用炎性细胞因子处理后，MSCs的主要模块仍显示出与未刺激状态下相似的模式。
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为了确定最初的UC-MSCs的特征基因是否也能显示出炎性细胞因子引发的MSCs中的亚群，我们采用了PCA分析。 我们发现先前发现的7个特征基因的表达水平在3个组中的第1组中最高(Fig. 2e)。有趣的是，与第2组和第3组相比，与第2组和第3组相比，第1组由MSCs介导的免疫调节关键细胞因子和趋化因子包括CCL5，IDO1，CXCL9，CCL2，PTGS2 / COX2，TNFAIP6 / TSG6和IL6）的表达最低(Fig. 2f)，而其他基因在所有3组中表现出相似的表达模式。可以在所有数据集中找到特征基因和免疫调节基因的这些反负相关(Figs. S8 and S9)。 这些结果表明，我们在UC-MSCs中发现的亚群七种特征基因表达水平高，同时具有较低的免疫调节基因表达水平。

The limited heterogeneity in expanded MSCs is linked to cell cycle stages

扩增的MSC中有限的异质性与细胞周期阶段有关

鉴于特征基因是细胞个体间基因表达变异性的代表，我们探讨这些特征基因是否可以用于MSCs亚群的鉴定标记。我们评估了七个特征基因在体外扩增的UC-MSCs群中的表达情况。观察到只有很小的一群细胞表达高水平的七个特征基因(Fig. S10)。七个特征基因中的CD168基因具有相对高的表达水平。随后，我们通过流式细胞仪分选分离出CD168阳性和阴性的MSCs(Fig. 3c)，分选的CD168高表达的MSCs与未分选的MSCs一起，分别比较了它们的形态，细胞表面标志物和增殖潜能(Fig. 3c)。在显微镜下，这些细胞表现出类似的纺锤形形态(Fig. 3c)。MTS实验显示，CD168阳性，阴性的MSCs和未分选的MSC的生长速率相似，与接种的细胞数量无关 (Fig. 3d)。此外，我们还评估了MSCs鉴定的一组标记基因，包括CD73，CD90，CD105，CD34，CD11b，CD19，CD45和HLA-DR。对于CD73，CD90，CD105的阳性和CD34，CD11b，CD19，CD45和HLA-DR的阴性没有显著差异(Fig. 3e)。有趣的是，当我们分析CD168在扩增的CD168 阳性MSC，CD168阴性MSC和未分选的MSC中的表达时，发现这些组中的CD168表达水平是可比较的（分别为0.99％，1.07％和1.80％）。(Fig. 3b)）。这些结果表明CD168阴性MSC可以恢复基因表达模式，因为CD168 阳性伴随扩增时发生，表明MSC之间的异质性具有局限性。
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为了研究MSCs中有限异质性的特征和形成，我们分析了每个数据集中各个模块之间的关系，如图Fig. 3f所示。值得注意的是，在蓝色和绿松石基因模块中，有或没有炎症刺激的UC-MSCs中基因表达存在显着差异（分别在huc1_ctrl和huc1_sti中为-0.69和-0.88）(Fig. 3f)）。GO富集分析进一步表明，与细胞迁移和细胞因子信号传导相关的通路在蓝色模块中富集，在绿松石模块与细胞周期活性相关的通路高度富集(Fig. 3g)。

我们基GO富集“细胞周期”和“免疫调节”中的注释得到了57个细胞周期相关基因和20个免疫调节相关基因的列表，并进行单细胞qPCR以确定它们在扩增的UC-MSCs中的表达情况。我们发现两个大的模块之间的细胞周期相关基因和免疫调节相关基因之间存在高度负相关(Fig. 3h)
。在UC-MSC的单细胞RNA测序中也可以观察到这种负相关性 (Fig. 2b, c and Figs. S8 and 9)。因此，我们的结果表明，UC-MSC中有限的异质性与细胞周期进展有关。

Cell cycle stage determines the heterogeneity of MSCs

细胞周期阶段决定了MSC的异质性

我们接下来检查了细胞周期轨迹对UC-MSCs中异质性的影响。我们采用基于评分细胞周期相关基因的分类方法，并描述每个细胞在G1/S和G2/M期中表达细胞的特征基因。
通过显示红色的CD168/HMMR阳性细胞，我们发现大多数细胞位于右上方，表明它们处于G2/M期 (Fig. 4a)
。为了进一步证实与细胞周期相关的其他特征基因（brca1，cdca5，melk，racgap1，prc1和hmgb1）的相关性，我们检查了它们的表达模式，发现它们的表达与CD168/HMMR 阳性的MSCs类似，富集在图的右上角(Fig. 4b)
。为了检查细胞周期阶段是否与这些特征基因在UC-MSCs中的高表达相关，我们使用了四种小分子抑制剂来阻止G1/S期（Abemaciclib和GGTI298）和G2/M期（Nocodazole）的MSCs。和伊沙匹隆）(Fig. 4c and Fig. S11)。用碘化丙啶（PI）染色显示MSCs中的DNA含量并确定细胞周期的阶段，我们分析了二倍体和四倍体细胞中CD168 +细胞的百分比。我们发现在G2/M期停滞的大多数MSC在CD168中呈阳性(Fig. 4c, d and Fig. S11)
。然而，在G1/S期停滞的UC-MSC表现出相反的模式(Fig. 4c, d and Fig. S11)。
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由于体外培养很大程度上降低了UC-MSCs中CD168/HMMR的表达，我们直接分析了分离出的CD168/HMMR阳性的MSCs与细胞周期相关基因的表达。 如所预测的，新分离的CD168/HMMR阳性MSC表达较低水平的G1/S基因，mcm2，而表达高水平的G2/M基因，aurkb和cdk1 (Fig. 4e)
。 表明细胞周期的G2/M期与这些指示的特征基因的关系，包括brca1，cdca5，hmmr，melk，prc1和racgap1。 我们将UC-MSCs分为G0/G1期和G2/M期，并使用实时PCR分析前述提到的基因的表达情况。 我们发现这些特征基因在G2/M细胞中的表达高于G0/G1细胞中的表达(Fig. 4f)。 总之，细胞周期阶段控制UC-MSCs的异质性。

Discussion

自第一例MSCs用于治疗患有类固醇和环孢菌素耐药GvHD的9男孩以来，各种随访研究都集中在MSCs在组织修复和再生方面的潜力研究[16,25]。MSCs治疗成功依赖于MSCs的质量，注射途径，患者状态和临床干预这个关键参数。MSCs的行业标准对于控制MSCs的质量至关重要。本研究，我们对来自两个不同供体和三个传代的UC-MSC进行单细胞RNA测序，我们对来自两个不同供体的三个代际的UC-MSCs进行单细胞RNA测序,并设置有无炎性细胞因子刺激两组。
我们发现，无论供体和代级如何，UC-MSCs中基因表达的异质性是有限的。此外，经炎性细胞因子（IFNγ和TNFα）刺激的UC-MSCs在基因表达中显示相似的多样性模式，表明有无炎性细胞因子刺激UC-MSCs均具有有限异质性。我们发现了包括brca1，cdca5，melk，hmmr，racgap1，prc1和hmgb1在内的七个特征基因。更深一步地分析显示，异质性在很大程度上与UC-MSCs的细胞周期阶段有关。

自从骨髓中首次鉴定获得MSCs后，如今几乎可以从所有的组织中获得MSCs。骨髓来源的BM-MSCs在临床应用中最为常见，与来自它组织中的MSCs相比，UC-MSCs具有大规模扩增和标准化的巨大潜力。UC-MSCs单细胞基因谱分析显示个体细胞存在异质性，不同细胞分别表现出明显的增殖和分化潜能。基于UC-MSCs大小的分类显示，形态较小的细胞生长更快，更为年轻。此外，利用多色慢病毒条形码标记作为UC-MSC克隆发育的分析工具，发现在体外扩增期间可以减少MSCs的异质性。
因此，体外扩增的MSCs间的异质性的鉴别和应用反应了它们在疾病治疗中应用的治疗机会。考虑到不同供体来源和扩增过程中可供选择的MSCs的克隆。

可以代表它们在疾病治疗中应用的新的治疗机会。考虑到不同供体​​来源和扩增过程中MSCs克隆选择的可能性，我们对来自不同供体和传代的UC-MSC的单细胞RNA测序分析描述了数据集之间的可变性非常保守，表明UC-的异质性有限。间充质干。以前的研究已经指出，培养条件也可以影响MSCs32的转录和蛋白质组谱。在存在炎症的情况下，来自不同供体的MSC可以提供解决DTH炎症的一致结果，这归因于由炎性刺激引发的不同供体MSC中免疫抑制分子的可比较和丰富的表达。这些结果提出了将异质MSC发展成同质群体的潜在方法。虽然炎症可以使MSC具有最重要的免疫抑制作用，并使得不同的供体来源的MSC具有类似的组织再生改善，但这些炎性细胞因子刺激的UC-MSC不是同质的。令人惊讶的是，它们的基因谱可变性的表达模式与未处理的UC-MSC相似。

为了揭示UC-MSCs有限异质性的本质，我们分析了特征基因，发现绿松石模块与细胞周期调控有非常密切的关系。令人意想不到的是观察到了细胞周期基因聚类的模块和免疫相关分子聚类的模块之间负相关性。我们发现UC-MSCs亚群大多处于G2/M期，UC-MSCs的异质性（有无炎性细胞因子刺激）均受细胞周期进程的控制。

总之，我们通过对UC-MSC单细胞RNA测序的分析揭示了UC-MSC的异质性主要是由细胞周期阶段的不同分布引起的。除了在研究MSC生物学方面有价值之外，该信息还对MSC标准化和采用MSC治疗各种疾病的发展具有重要意义。

Methods and materials

Single cell capture and quality control

MSCs were captured on a large microfluidic chip (designed for cells from 17 to 25 μm) using the Fluidigm C1 Autoprep System. Capturing efficiency was evaluated by microscopic observation; each capture site was manually confirmed with single cell and processed further. RNA degradation and contamination was monitored on 1% agarose gels. RNA purity was checked using the NanoPhotometer spectrophotometer (IMPLEN, CA, USA). RNA concentration was measured using the Qubit RNA Assay Kit in Qubit 2.0 Flurometer (Life Technologies, CA, USA). RNA integrity was assessed using the RNA Nano 6000 Assay Kit of the Bioanalyzer 2100 system (Agilent Technologies, CA, USA). Quality control was performed by Novogene Co., Limited.

Library preparation and sequencing

Sequencing libraries were generated using the NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, USA) following manufacturer’s recommendations and index codes were added to attribute sequences to each sample. PCR products were purified (AMPure XP system) and library quality was assessed on the Agilent Bioanalyzer 2100 system. The clustering of the index-coded samples was performed on a cBot Cluster Generation System using the TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumia) according to the manufacturer’s instructions. After cluster generation, the library preparations were sequenced on an Illumina Hiseq 2500 platform and 50 bp single-end reads were generated. These procedures were achieved by Novogene Co., Limited.

Data analysis

Raw data (raw reads) of fastq format were firstly processed through in-house perl scripts. In this step, clean data (clean reads) were obtained by removing reads containing adapter, poly-N and low quality reads from raw data. At the same time, the clean data of Q20, Q30 and GC content were calculated. All the downstream analyses were based on the clean data with high quality.

Reference genome (hg19) and gene annotation file (UCSC RefGene) were downloaded from illumina iGenomes. Index of the reference genome was built using Bowtie2 (v2.2.5) and single-end clean reads were aligned to the reference genome using Top Hat (v2.1.0).

Quantification of gene expression level

HTSeq v0.6.1 was used to count the reads numbers mapped to each gene. To normalize sequencing depth, the size factors was calculated by estimate SizeFactorsForMatrix function in R package DESeq2. Normalized counts were calculated by divided raw counts of each genes by size factor of each samples.

Subgroup identification and differential expression analysis

We applied R package SCDE to identify subpopulations of MSCs. Briefly, spike-in RNAs were used to calculate a regression line of gene expression levels and variations, single-cells were grouped into subpopulations by hierarchical clustering with genes that significantly deviation from the fit. Differential expression analysis of two conditions/groups (two biological replicates per condition) was performed using the SCDE R package. The SCDE package implements routines for fitting individual error models for single-cell RNA-seq measurements by using a mixture of a negative binomial distribution and low-level Poisson distribution to model each gene. Genes with P-value < 0.05 found by SCDE were assigned as differentially expressed.

GO analysis of differentially expressed genes

GO enrichment analysis of differentially expressed genes was implemented by the topGO R package. GO terms with corrected P value < 0.05 were considered significantly enriched by differential expressed genes.

Weighted gene correlation network analysis (WGCNA)

A signed network was constructed by using genes that significantly deviated from SCDE fit in each dataset. Soft power 12, which is the default parameter, was used to derive a pair wise distance matrix for selected genes using the topological overlap measure, and the dynamic hybrid cut method was used to detect clusters. The node centrality, defined as the sum of within-cluster connectivity measures, was used to rank genes for “hub-ness” within each cluster. For visual analysis of the constructed networks by hard thresholding of edge distances, the closest 150 edges were represented using Cytoscape 3.0.0.

Based on the gene modules identified by WGCNA analysis, we screened the genes in blue and turquoise modules with three criteria: (1) highly expressed in one specific subcluster compared to the other clusters; (2) the subcluster specific expression existed in more than one dataset; (3) expressed on the cell surface. Finally, we identified seven featured genes: brca1, cdca5, hmgb1, hmmr/cd168, melk, prc1, and racgap1.

表达矩阵下载：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE117837

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