title：The adult human testis transcriptional cell atlas
journal：cell research
IF：17.8
摘要：成年人的精子发生包含了精原干细胞的自我更新和分化过程，与此同时还有生殖细胞与周围环境的相互作用，以确保长期的生殖能力和可靠的基因组复制，在这里，我们进行了单细胞RNA测序，样本来自年轻成年个体的6500个睾丸细胞，我们发现了五种睾丸体细胞（间质细胞，内皮细胞，支持细胞，肌细胞和巨噬细胞），同时观察到生殖细胞与环境的互作以及人与鼠的不同之处。精子发生，是一个精密建立的过程，包含一些编码、非编码及重复片段的转录活动。有趣的是，我们发现了五种分离的转录/发育中的精原细胞状态，其中包括了一种新的较早时期的精原干细胞阶段，在此定义为state0.表观特征及转录分析揭示了在精原细胞阶段发育的可塑性，为了理解state0的来源，我们使用婴儿的睾丸细胞做了转录组，确定了成年人中的state0与婴儿精原干细胞的相似性。总之，我们的数据集描述了关键的转录和表观特征，同时发现了生殖细胞发育转化过程及其可塑性。
介绍：人类精子发生过程需要维持精原干细胞的自我更新和分化过程的平衡，随后会在轴为环境的主导下完成多个过程的转化，然后进入有丝分裂和减数分裂，随后是精子的成熟过程。
这其中的很多生物学问题可以通过单细胞测序过程解决，比如是那些分子特征保证了精原干细胞可以作为一种长期的成年的生殖干细胞？精原干细胞的转化过程（从起源到幼稚期到静息阶段发育成精原细胞）是如何实现的？这些过程是否是不可逆的？或者是精原细胞的发育是否存在双向的可塑性确保精原干细胞池可以长存？精原细胞时期结束后，有哪些过程在随后的转录和信号过程中发挥作用？这些过程是如何影响体细胞与生殖细胞的交流，这些交流的分子是否是特殊的一些信号或者转录通路，从而调控精原细胞的自我更新、增殖代谢和转化？
在此我们使用了10X的平台对年轻成年人的睾丸细胞进行分析，找到了五个分离的精原细胞状态，同时发现了一种新的状态.有趣的是，结合RNA动力学分析和染色质可及性分析及DNA甲基化分析，我们发现了人精原细胞分化过程中的可塑性。
结果：
1、细胞组分分离和鉴定
筛选标准：250k reads/cell ，2500 gene/cell
macrophages CD14 CD163 C1QA
endothelial cell VWF PECAM1 NOTCH4 JAG1 HES1 MAML1
myoid MYH11 ACTA2
sertoli cell SOX9 AMH ITGA6
lydig cell DLK1 IGF1
SSC marker UTF1 ID4 FGFR3
differentiating marker KIT DMRT1
meiosis marker SYCP3 SPO11 MLH3
spermatid structure protein SPAG6 ZZPBP CAMK4 CREM
nuclear condensation protamine repackaging factor TNP1 PRM2
定义前细线期、细线期、偶线期、粗线期、后粗线期、双线期的marker：STRA8 REC8 SPO11 SYCP1 PRDM9 MSH5 MSH4 MLH3 CCNA1
2、人和小鼠的睾丸环境及体细胞与生殖细胞互作的比较
以前的研究报道了支持细胞中表达CXCL12作为CXCR4的配体来帮助维持精原干细胞的状态，而在人中，这种配体在间质细胞中表达，而CXCR4则在巨噬细胞和精原细胞中都表达。说明了CXCL12-CXCR4在人中会促进巨噬细胞和精原细胞的共定位。再者，CSF1R,作为CSF1的受体，在人中特异性表达在巨噬细胞中，而在小鼠中表达在精原细胞中。
在人类中，支持细胞表达ITGA6，这是一种整合素，可在曲细精管的基底部发现。同时支持细胞会表达WFDC2和PRND。前者是一种附睾蛋白会促进精子成熟，后者是一种锚定蛋白会与生殖细胞上的受体互作。
在间质细胞中也会有特异表达的基因，比如IGFBP5 IGFBP3和INHBA以及VIT。有趣的是睾酮合成相关的基因如STAR和HSD17B3会在支持细胞和间质细胞中高表达，而其效应基因如SHBG等在成熟的精子中表达。RA合成的相关基因如ALDH1A1和ALDH1A3，高表达于间质细胞和内皮细胞，而其靶基因STRA8，只在精原细胞向精母细胞的转化时期表达。WNT信号通路中的配体WNT2B最初表达在内皮细胞中，而其受体则表达在精母细胞中，这说明其重要的作用。
PDGFB表达在内皮细胞中，而它的受体PDGFRA和PDGFRB则在间质细胞和肌细胞中表达，说明其可能是通过于其他生境细胞互作而间接影响生境过程的。
PS，可以在GSEA的数据库中查找别的信号通路，看一下表达模式
3、拟时序分析和聚类分析揭示了精子发生过程中的剧烈的基因表达模式
聚类分析中的热图解读：行代表基因，列代表按照逆事件顺序排列的基因
GO分析，根据每个cluster代表的细胞所发生的生物学过程排序，上调和下调的GO都做（重点！！！）
差异基因的筛选使用了bimodel test ，阈值FDR<0.01,logFC的绝对值大于0.25
4、转座元件、lncRNA和XIST的生殖系表达的动力学
XIST和MSCI：XIST在精原细胞阶段出现表达，同时发现在精原细胞阶段靠近X失活中心的基因被选择性的抑制，揭示了XIST介导的时候过程，MSCI指的是meiotic sex chromosome inactivation
5、减数分裂的细胞的分析揭示了在减数分裂转化过程中的剧烈变化和关键调控因子。
我们发现DMRT和SOX家族的蛋白的动态表达模式，这于他们在小鼠减数分裂进入过程的抑制作用是一致的，DMRT1和SOX4只表达在前细线期。
5、已知的和未知的精原干细胞状态的定位
重聚类了早期精原细胞，获得了四个与以前报道相似的簇和一个以前未被报道的簇，同时发现了转录活动中的剧烈的转化在1-2的阶段转变中（这个是重点！！！），说明这个转化是比较重要的发育节点。
尽管state0和state1有一些细胞共表达一些关键的干细胞信号因子和转录因子，我们的分析发现了有490个基因在state0中特异性表达或者有较高的表达，比如说PIWIL4 EGR4 TSPAN33 PHGDH PPP1R36等
一些已知的早期SSC的marker基因如ID4 FGFR3 TCF3 UTF1等在stat0和stat1中表达，而一些分化（KIT）或者扩增（MKI67）等基因却发现是在State2中高表达，这说明0和1是两个代表ssc静息状态的中间阶段。有趣的是大多数state0低表达ST3GAL2，这是一种参与SSEA4形成的酶，这说明0这个状态并不能表达精原细胞的表面marker
6、RNA速度分析及染色质状态揭示精原干细胞的可塑性
随后做了RNA速度分析，这是通过利用新生的转录来推测发育的轨迹。这个算法中每个转录本的未剪接读数与剪接读数之比被用作新转录量的代理测量。（原文Here, the ratio of unspliced to spliced reads for each transcript is used as a proxy measurement of new transcription.），通过比较其他细胞中稳定状态（spliced）的转录本，一个可以用来代表每个细胞未来的转录状态的速度向量就可以被计算出来，在tsne图中，向量的长度和方向代表了细胞的转录轨迹，这个分析揭示了两个信息，第一个是在state0中，我们发现存在两个亚群，其中一个亚群的向量指向state1，说明它会向1阶段发展，而第二个亚群没有很明确的指向，这两个亚群的模式说明了前者的细胞亚群具有向1阶段发展的趋势，可能是受到特殊的发育信号的调控，而后者则没有。第二个现象是，在state2中，我们发现其中有一部分的细胞的向量指向了state1，说明人类精原细胞的发育是有可塑性的。
7、成年人state0与胎儿的生殖细胞状态很相似
为了验证state0是代表最早期的ssc的细胞，我们使用了12-13个月大的胎儿的睾丸细胞，通过QC后获得了1300多个这样的细胞，其中也包含了一些体细胞。tsne和拟时间分析发现胎儿的生殖细胞非常接近state0细胞，处于发育轨迹的最开始的位置，更重要的是，大多数的state0的marker高表达于胎儿生殖细胞中。其中也包含了一些重要的转录因子（TBX3 HOXA3）等是特异性表达在胎儿生殖细胞中的，这可能导致了出现差异的原因
8、确定精原干细胞的状态通过随后的mrna原位荧光杂交
9、state0的markerTSPAN33显示与高表达的FGFR3共定位
使用鉴定得到的TSPAN33作为state0的表面marker对0阶段的细胞进行富集，发现这些细胞都表达高的FGFR3同时低表达SSEA4。
10、早期精原干细胞状态的原位观察通过蛋白免疫荧光
除了使用实验外，还引入了人类蛋白图谱的数据库的数据加以佐证。
技术参数：
1、10X平台+ illumina hiseq2500
2、下机数据使用cell ranger v1.2.1处理
3、下游处理
细胞身份确定：Seurat ，筛选标准是500genes/cell 20%线粒体基因/cell 标准化：scaledata函数，var。regress=“nUMI"和“mitochondria percentage”，使用RunCCA去除批间差，最后选5000个hvg以及1—15PC作为聚类依据
拟时间分析：slingshot
细胞周期分析：scran
调控子分析：SCENIC
RNA速度分析：Velocyto.R
