Nat Rev | CRISPR在癌症研究和治疗中的应用
原创 骄阳似我 图灵基因
收录于话题#前沿分子生物学技术
撰文：骄阳似我
IF：60.716
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亮点：
本文作者带我们详细回顾了基因编辑技术CRISPR的发展史，并且介绍了CRISPR在不同细分领域，包括科研和临床的重要作用。在科学研究中，CRISPR技术帮助科学家更深层次得理解癌症和基因组的原理，在癌症治疗方面，CRISPR也展现出了非凡的创造力，同时对于CRISPER的局限性作者也进行了探讨。总之作者作为导游，带领我们在“CRISPR科学馆”进行了一场图文并茂的畅游。
癌症是一种复杂的疾病。从根本上说，它是一种基因组疾病，由DNA突变引起，激活致癌基因，使肿瘤抑制因子失活，以及协调正常表达的表观基因组的失调。它也是一种细胞疾病，以新陈代谢、细胞结构和运动性的变化为食，使其能够在不适宜的环境中生长。最终，它是一种生物体的疾病，利用正常的细胞类型和组织功能，并绕过宿主的防御系统。了解基因组的变化、细胞适应和对微环境的变化是如何驱动个体癌症的起始、进展和治疗反应的，这对于开发更有效的治疗方案和改善每年数百万癌症诊断患者的结果至关重要。
CRISPR和CRISPR相关(Cas)蛋白是一个古老的细菌适应性免疫系统的关键组成部分。在过去的30年里，数百名科学家为理解CRISPR生物学和CRISPR技术的发展做出了贡献。它已经成为一种在几乎所有细胞类型中可编程基因组修饰的工具。
近期，在Nature reviews cancer杂志上发表了一篇名为“CRISPR in cancer biology and therapy”的综述文章，本文的作者以其渊博的知识带领我们了解了基因编辑技术CRISPER技术的发展史以及CRISPR在科学研究和临床治疗中的重要作用。
CRISPR是当下最热门的基因编辑技术。最常用的CRISPER系统是化脓性链球菌(SpCas9)的ii型CRISPR-Cas9系统，这是一种DNA内切酶，通过可编程引导RNA(gRNA)分子(gRNA)在特定基因组位点诱导双链断裂，使CRISPR-DNA碱基配对。为了使SpCas9能够有效地结合和切割DNA，目标序列必须在3‘侧有一个“NGG”原间隔子邻近基序(PAM)序列。Cas9创建的DSB可以通过精确的同源定向修复(HDR)解决，更常见的是通过容易出错的非同源端连接(NHEJ)或微同源介导的末端连接(MMEJ；也称为替代NHEJ(Alt-NHEJ))。HDR可以引入特定的变化，而可以利用NHEJ中的插入和删除（插入）来破坏编码和非编码序列。
自从CRISPR系统在真核细胞中首次实施以来，变异酶的迅速扩展，扩大了基于CRISPR的平台的能力。变异的一个来源是Cas9同源物，如金黄色葡萄球菌Cas9或其他Cas酶(例如Cas12).CRISPR不仅已成为基因编辑应用中的有用工具，而且还可以利用死亡的Cas9D10A/H840A(dCas9)研究靶向转录和表观基因组机制。图1.可应用于癌症生物学研究的CRISPR工具的发展史
基因编辑是CRISPR最核心的技术。其重要应用主要体现在以下几个方面：
①通过CRISPR敲除揭示基因功能。除了简化在已建立的癌细胞系中创建简单的基因破坏的过程外，CRISPR还能够快速创建复杂的类器官培养物和动物模型。由于CRISPR-Cas技术的简单性和效率，KO小鼠的生产已成为机构核心设施和商业实体的常规做法（图2a）。创建体内KO癌症模型的另一种策略是将所有CRISPR成分引入体细胞组织，或通过体外操作和移植培养细胞，或通过直接在体内靶向(图2b)。除了动物模型，CRISPR结合3D培养系统的技术进步，促进了定制和基因定义的人类癌症模型的发生，以询问基因功能和测试新的治疗方法(图2c)。Sato和Clevers在人类结肠类器官中建立了更复杂的模型，在腺瘤性息肉病(APC)、KRAS、TP53、SMAD4和PI3Kα(PIK3CA催化亚基)中重建了多达5个不同的致癌突变(图2d)，证明了已知或疑似驱动因素中的KO突变可导致体内肿瘤，随后可用于研究药物反应。
②综合基因筛选。CRISPR在癌症研究中影响最大的地方是综合基因筛选。由于易于设计、克隆、效率和改进的sgRNA文库的持续开发，使得CRISPRKO筛选成为询问癌症基因功能的“首选”方法。通过全基因组文库的体外转导和随后的植入受体小鼠，作者的研究团队确定了非小细胞肺癌(NSCLC)转移的潜在调控因子(图2e)。
③理解错义突变。癌症中绝大多数的突变是单核苷酸变异(SNVs)，它可能导致蛋白质功能的低、超或新形态变化。CRISPR主要在两大方面对我们设计和研究snv的能力产生了影响。首先，通过靶向DNAdsb的能力，它增强了基于hdr的基因靶向性，其次，通过Cas融合酶，它能够直接进行DNA修饰。图2.应用CRISPR技术构建癌症模型的过程
在过去的十年里，人类基因组非编码区的一些突变与癌症风险有关。因为这些非编码区域包含不同的功能元件，调节致癌基因、肿瘤抑制因子和相关基因的表达。在非编码区，CRISPR技术也有重要的作用。一些研究小组已经使用混合饱和诱变CRISPR核酸酶筛选来识别一个或多个基因周围的必要的顺式调节元件。科学家可以利用Cas9敲除靶向非编码区，对非编码区进行抑制或者激活。通过使用CRISPRi和CRISPRa筛选，一些研究小组已经确定了癌细胞类型特异性的非编码突变。Engreitz和同事靶向两个编码癌细胞增殖转录因子的基因两侧区域gata1和myc，识别了9个有助于白血病细胞基因表达和细胞增殖的增强子。Gersbach和他的同事使用CRISPRi和CRISPRa来检测了各种人类细胞系中β-球蛋白和癌基因人表皮生长因子受体2(HER2)周围的增强子。这种策略使必要增强子(CRISPRi)和充分增强子(CRISPRa)之间得以功能区分，以促进癌基因表达，并突出细胞类型特异性增强子活性。这些研究表明，基于dcas9的工具可以揭示肿瘤特异性增强子，这可能导致新的治疗策略。
图3.各种CRISPR效应子的功能域及其在基因组规模筛选中的应用
癌症不是单基因、单克隆或静态性疾病。癌细胞不断地获得改变，从而导致复杂的遗传和表观遗传学图谱，CRISPR技术可以模拟癌症中复杂的突变谱。克隆衍生物随着癌细胞群进化成不同和不同的突变实体而发生分支和竞争，而肿瘤的细胞间组成（癌细胞、间质和免疫细胞）是非常动态，而CRISPR技术也可以追踪肿瘤中的进化动态。了解肿瘤内的异质性和肿瘤亚克隆的出现和进化对于建立肿瘤发生的完整图景非常重要。所以CRISPR技术特别适合于解决这些困难的问题，使研究人员能够在细胞群中设计复杂的癌症相关突变，并追踪克隆进化。图4.利用CRISPR技术进行谱系追踪，以记录肿瘤的异质性
多个研究小组已经表明，体外基于CRISPR的PD1靶向于T细胞可以在过继转移后增强抗肿瘤活性。在一项初步的临床研究中，工程T细胞显示出较低的脱靶编辑和最小的不良事件。在一项独立的临床研究中，患者T细胞使用CRISPR-Cas9grna介导的KO进行类似的工程；然而，PD1单独或联合内源性TCR和T细胞受体与基因组中随机整合的相比，CAR均匀表达，增加CART细胞的效力。在人类细胞中的CRISPR编辑并非没有问题。Cas9诱导脱靶切割，在编辑的T细胞中发现了染色体重排将CAR元件整合到CARACT细胞工程的TRAC位点；这两种策略都有助于促进肿瘤特异性细胞毒性T细胞作为治疗癌症的免疫治疗方法的抗肿瘤疗效。图5.人T细胞的体外CRISPR工程用于过继T细胞治疗
尽管CRISPR在癌症生物学中有广泛的应用，但其使用仍有一些局限性和关注，特别是在治疗环境中。在某些情况下，这可能导致肿瘤抑制因子的丢失，并损害其他正常的细胞功能。虽然CRISPR仍然是一项相对年轻的技术，但它已经影响了癌症生物学的几乎所有方面，催化了大量功能数据的生成，并对一种已经被充分研究的疾病揭示了无数的新见解。然而，还有更多的东西需要学习。作者相信，在未来的5-10年里，CRISPR将迈出它在临床医学领域真正的第一步。
教授介绍：
Neville E. Sanjana博士，2001年毕业于斯坦福大学，2010 年取得麻省理工学院（脑与认知科学）博士学位。主要研究领域：基因组学、神经科学、癌症生物学。
Neville E. Sanjana的实验室开发新技术来了解人类基因变异如何导致神经系统疾病和癌症他的的团队针对非编码基因组开发了汇集CRISPR文库和基因编辑的方法。同时他们使用多学科的方法，结合基因组工程、汇集基因筛查、生物信息学、电生理学和成像，剖析人类基因组的内部工作机制及其在自闭症和肿瘤进化中的功能障碍。
参考文献：
Alyna Katti et al. CRISPR in cancer biology and therapy [J].Nature reviews cancer. 2022 Feb 22:s41568-022-00441-w
