文献背景
1、题目：Aberrant R-loop–mediated immune evasion, cellular communication, and metabolic reprogramming affect cancer progression: a single-cell analysis
2、发表杂志及时间：Mol Cancer. 2024; 23: 11.
3、作者信息及单位：Shichao Zhang,1 Yang Liu,1 Yichi Sun,1 Qin Liu,1 Yan Gu,2 Ya Huang,2 Zhu Zeng,*1 Fuzhou Tang,2 and Yan Ouyang2
1贵州省感染免疫与抗体工程重点实验室、贵州省细胞免疫治疗工程研究中心、贵州医科大学 2贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心、贵州省医学科学院生物与医学工程重点实验室，中国贵阳大学
通讯作者：朱曾，电子邮件：nc.ude.cmg@uhzgnez。
文献概述(这篇文献的结论是什么？)
作者全面分析了 TME 中 R 环的分布模式，发现低分 R 环的分布表现出由 T 细胞耗竭介导的免疫抑制微环境，从而促进肿瘤进展，并为免疫逃逸和免疫逃逸机制提供了见解。低分 R 环分布下代谢重编程介导的药物耐受性。这项研究的结果提高了对 R 环分布介导的代谢异质性和 TME 重塑的理解。这项研究进一步强调了异常 R 环在癌症发展中的因果作用。这些知识对于设计个体化治疗策略至关重要，并且可以指导基于 R 环或 R 环调节器开发更有效的 LUAD 治疗方案。
文献结果(每个结果的图片详细解读)
正文中总共包含了8张图片，注意介绍并整理思路和结果。
图1. 与肺腺癌 (LUAD) 进展相关的恶性细胞的 R 环评分
A 从 GEO 数据集（GSE123904 和 GSE131907）获得的 30 个 LUAD 样本的临床和分子特征，以及每个样本中细胞类型的比例。 B 根据细胞类型或个体患者着色的 92,842 个细胞的均匀流形近似和投影 (UMAP) 图。 27 个已识别的恶性细胞亚组的 C UMAP 图。 D 1,185 个 R 环调节因子的加权基因共表达网络分析 (WGCNA)。颜色越深表示相互作用越强。 E 来自紫色、棕色、洋红色和粉色模块的 92 个 R 环调节器的相互作用图。 F 根据R-loop评分的中值将恶性肿瘤细胞分为高评分组和低评分组。折线图显示了每个亚组中恶性细胞的数量，得分高的恶性细胞呈橙色。 G 不同条件下恶性细胞的 R 环评分差异（Wilcoxon 等级检验）。 H 基因集变异分析 (GSVA) 显示具有高 R 环评分的恶性细胞和具有低 R 环评分的恶性细胞之间富集途径的差异（贝叶斯 t 检验）。 (*p < .05, **p < .01, ***p < .001)
第一步，获取LUAD的单细胞公共数据，PMC检索(((((lung cancer[Title]) OR (lung adenocarcinomas[Title])) OR (NSCLC[Title/Abstract])) OR (lung tumor[Title/Abstract])) OR (neoadjuvant immunotherapy[Title])) AND (((single-cell transcript*[Title/Abstract]) OR (single-cell RNA[Title/Abstract])) OR (scRNA-seq[Title/Abstract])) AND (y_5[Filter])，结果为GSE123904, GSE131907, PRJNA591860, and GSE146100
第二步，基于已知的1,185 个 R 环调节因子构建加权基因共表达网络分析 (WGCNA)
第三步，使用R package ‘CRDscore’，根据计算R环得分
第四步，基因集变异分析 (GSVA) ，研究了高和低 R-loop 评分亚组之间涉及基因的信号通路的差异
图2. R-loop 评分与抗 PD-1 免疫治疗反应呈正相关。
A 来自 GEO 数据集（GSE123904 和 GSE131907）的恶性细胞免疫逃逸分子谱在高 R 环评分和低 R 环评分亚组之间的变化，以及两个不同评分亚组之间富集免疫原性细胞死亡 (ICD) 途径评分的差异，使用单样本基因集富集分析（ssGSEA，Wilcoxon 等级检验）。 B 具有高 R 环分数和低 R 环分数的样本中免疫细胞、恶性细胞和其他细胞的比例。 C 来自 R 环得分高和 R 环得分低的患者的八种免疫细胞类型以及初始、细胞毒性和功能障碍 T 细胞的比例（Wilcoxon 等级检验）。 D 具有高 R 环评分和低 R 环评分的恶性细胞之间 NK 细胞耗竭评分的差异（Wilcoxon 等级检验）。来自单细胞 RNA 测序数据 (GSE146100) 的 11,515 个细胞的 E T 分布随机邻域嵌入 (t-SNE) 图，根据细胞类型或个体患者进行着色。每种细胞类型的 F R 环评分，例如恶性细胞、内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞和免疫细胞（Wilcoxon 等级检验）。 G 根据治疗反应或 R 环评分着色的恶性细胞的均匀流形近似和投影 (UMAP)。 H 对癌症治疗有反应的患者与无反应的患者之间 R 环评分的差异
第五步，单样本基因集富集分析（ssGSEA），免疫原性细胞死亡 (ICD) 途径评分计算
图3 细胞通讯和细胞因子相关通路网络分析
A-C 恶性细胞和 T 细胞亚型之间通过趋化因子 (A)、共刺激分子 (B) 和共抑制分子 (C) 进行细胞间相互作用。圆圈大小显示 p 值，颜色表示配体-受体分子的表达水平。 D-F M1/M2 样巨噬细胞和 T 细胞亚型之间通过趋化因子 (D)、共刺激分子 (E) 和共抑制分子 (F) 的细胞间相互作用。 G-H R 环高分 (G) 或低分 (H) 条件下恶性细胞/巨噬细胞与 T 细胞亚型之间的配体受体连接。配体受体分子呈黄色（趋化因子）、棕色（共刺激分子）和青色（共抑制分子）。 I 从具有高 R 环评分的恶性细胞或 LUAD 患者中鉴定出的 21 种细胞因子途径的活性与巨噬细胞标记和 T 细胞标记基因呈正相关（r > .2，p < .05）。圆圈大小表示标记基因的比例。 J 具有高和低 R 环分数的恶性细胞、T 细胞和巨噬细胞中多种细胞因子的信号传导活性。每种细胞因子的活性值通过颜色区分
第六步，细胞通讯分析。具体方法：使用CellphoneDB 分析细胞通信，根据从STRING数据库获得的带注释的配体-受体对，计算它们的平均表达水平。随后，我们收集了 CellphoneDB 返回的具有显着值 (p<0.05) 的配体-受体对。最后，我们使用这些确定的对来分析两种细胞类型之间的相互作用。此外，考虑到细胞因子在细胞通讯中的关键作用，使用 CytoSig 确定转录组谱中细胞因子信号转导的活性 。
图 4 R 环评分与酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 治疗反应呈正相关
A 来自国家生物技术信息中心 (NCBI) 生物项目 (PRJNA591860) 的 30 个样品的 23,420 个细胞的均匀流形近似和投影 (UMAP) 图；它们根据细胞类型着色。 B 根据上皮标记基因的表达，对恶性细胞、上皮细胞、黑素细胞、免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞等每种细胞类型进行上皮评分。这些细胞类型在开始靶向治疗 (TN)、完全或部分缓解状态 (RD) 和疾病进展 (PD) 的患者中的分布。这些细胞类型之间 R 环评分的差异（Wilcoxon 等级检验）。根据 TKI 亚组着色的恶性细胞或免疫细胞的 C T 分布随机邻域嵌入 (t-SNE) 图。根据 TKI 亚组或 R 环评分着色的恶性细胞的 D UMAP 图。 E 高 R 环评分和低 R 环评分患者之间总生存率的差异（对数秩检验）。根据细胞总数的平均值计算癌症样本的FR-loop评分（Wilcoxon等级检验）。 G PD 和 RD 样本中具有高 R 环评分的恶性细胞的富集通路。标准化富集分数 (NES) 表示富集信号通路的分数。 H 基因集变异分析 (GSVA) 显示具有高 R 环分数和低 R 环分数的恶性细胞之间富集代谢相关途径的差异（Wilcoxon 等级检验）。 I 能量代谢相关基因与 R 环评分负相关。散点图显示了已识别基因（例如 ATP5F1B 和 UQCRFS1）与 R 环评分之间的关系。 x 轴和 y 轴上的边缘箱线图分别显示 R 环得分的分布和已识别基因的表达水平。 (*p < .05, **p < .01, ***p < .001)
第七步，下载公共数据PRJNA591860，绘制聚类图。计算上皮评分，方法是根据上皮基因的表达。计算R环得分。生存差异分析。功能富集分析。
图 5 R-loop 评分与预后相关
A 使用 smoothHR 对所有时间死亡风险对 R 环评分的依赖性进行非参数估计，以及高和低 R 环评分患者之间总体生存率的差异（对数秩检验）。 B 基于 Cox 比例风险模型（对数秩检验）的风险比（HR；95% 置信区间）。 TCGA 中 33 种肿瘤类型的 C R 环评分。 D 22 种 TCGA 肿瘤类型中肿瘤组织与邻近正常对照之间 R 环评分的差异（对数秩检验）。基于 33 种肿瘤类型的单变量或多变量 Cox 比例风险模型的 E HR（95% 置信区间）（对数秩检验）
第八步，下载TCGA的33种肿瘤数据，评估R环得分的预后效应。
图 6 R-loop 评分与预后和治疗反应相关
A 根据 R 环评分比较来自 GSE42127 (NSCLC)、GSE14814 (NSCLC)、GSE25055 (BRCA)、GSE25056 (BRCA)、GSE32603 (BRCA) 和 GSE63885 (OV) 队列的化疗患者的总体生存概率（对数秩检验）。 B GSE25055 (BRCA)、GSE25056 (BRCA)、GSE20194 (BRCA)、GSE41998 (BRCA) 和 GSE3964 的进展性疾病/无应答 (PD/NR) 组和应答 (RD) 组之间的 R 环评分比较（ CRC）接受化疗的队列（Wilcoxon 等级检验）。 C 接受靶向治疗的 GSE61676 (NSCLC)、GSE31428 (NSCLC)、GSE41994 (BRCA) 和 GSE16391 (BRCA) 队列中 R 环评分高的患者与 R 环评分低的患者之间总体生存概率的差异。 D 接受靶向治疗的 GSE61676 (NSCLC)、GSE68871 (MM)、GSE16391 (BRCA)、GSE109211 (LIHC) 和 GSE99898 (SKCM) 队列的 PD/NR 和 RD 样本之间的 R 环评分差异（Wilcoxon 等级）测试）。 E 接受免疫治疗的 GSE78220 (SKCM)、GSE135222 (NSCLC)、IMvigor210 (BLCA) 和 PMID32472114 (ccRCC) 队列中 R 环分数高和低的患者之间总体生存概率的差异。 F 接受免疫治疗的 GSE135222 (NSCLC)、IMvigor210 (BLCA)、GSE78220 (SKCM)、GSE91061 (SKCM) 和 PMID32472114 (ccRCC) 队列的 PD/NR 和 RD 样本之间 R 环评分的差异（Wilcoxon 等级检验） ）。 G 免疫治疗 R 环评分模型在 6 种肿瘤类型的 16 个相关数据集中的总体预测准确性。 (*p < .05, **p < .01, ***p < .001)
第九步，进一步在大量公开数据集中验证R环得分的预后和治疗反应的效能。
图 7 FANCI 敲低影响 R 环分布，抑制 Ras 信号通路
A PC-9 的全基因组 R 环信号图谱。 B R 环峰的百分比分布为基因间、启动子、基因体和终止子区域。 C TCGA-LUAD 中肿瘤组织和正常对照组织之间 FANCI 表达的差异（Wilcoxon 等级检验），以及 FANCI 高表达和低表达患者之间总生存概率的差异（对数等级检验）。 D shRNA 诱导基因沉默，降低 FANCI mRNA 和蛋白质水平（学生 t 检验）。 E PC-9 和具有 FANCI 敲低的 PC-9 之间的 R 环信号谱比较。 F PC-9 和 FANCI 敲低的 PC-9 之间基因间、启动子、基因体和终止子区域中不同 R 环峰的比例。 G 京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 分析对照和 FANCI 敲低 PC-9 细胞之间 R 环分布具有统计学显着差异的基因。 H-I FANCI 沉默降低了 PC-9 细胞中 RasGRF1、p-PI3K、p-AKT、p-IKK、p-65 (H) 以及 p-Raf1、p-MEK 和 p-ERK (I) 的蛋白水平。转录起始位点（TSS）和转录终止位点（TTS）。 (*p < .05, **p < .01, ***p < .001)
第十步，首先去证明FANCI 敲低影响 R 环分布，抑制 Ras 信号通路。具体方法：首先shRNA 诱导基因沉默，降低 FANCI mRNA 和蛋白质水平；具有 FANCI 敲低的 PC-9 之间的 R 环信号谱比PC-9 的 R 环信号谱低；探究FANCI 敲低的 PC-9 影响哪些区域的R环；对照和 FANCI 敲低 PC-9 细胞之间 R 环分布具有统计学显着差异的基因，进行功能富集分析；western-bot分析FANCI 沉默降低了 PC-9 细胞中哪些蛋白水平。
图8 FANCI敲低限制细胞增殖、集落形成、迁移、侵袭和肿瘤形成能力并促进细胞凋亡。
A shRNA 诱导基因沉默，降低 A549 中的 FANCI mRNA 和蛋白质水平。 (B-E) FANCI 敲低明显抑制 PC-9 和 A549 的增殖 (B)、集落形成 (C)、划痕愈合 (D)、迁移和侵袭 (E) 能力。 F FANCI 沉默促进 PC-9 和 A549 的凋亡。 G FANCI 沉默抑制了 PC-9 的肿瘤形成能力。 （学生 t 检验；*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001）
最后，探究FANCI敲低的作用结果。
文章亮点(这篇文献的优点在哪？)
这篇文章充分利用了R-loop得分这个指标，使用公共数据库TCGA验证了其预后效能；并且，使用公共的单细胞测序数据对肺腺癌进行分析；最后进行实验验证。数据充分，逻辑严谨。
我的疑问(这篇文献的不足在哪？)
个人困惑——Fig.7 G （The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analysis for genes with a statistically significant difference in the R-loop distribution between control and FANCI-knockdown PC-9 cells.）不知道显著差异的基因是怎么确定的，网上查到“diffbind 建议至少2组，每组3个重复，没有重复的样本不能使用”，文中shRNA的有2个，cntrol有一个，与网传不符。目前正在尝试中。。。
和我相关(我从这篇文献里学到了什么？)
文章中使用了很多指标，比如R-loop得分，比如上皮得分，比如免疫原性细胞死亡 (ICD) 途径评分等等；对单细胞数据进行了细胞注释、细胞聚类、细胞通讯研究等研究；对于肿瘤患者进行了生存预测、耐药机制、免疫逃逸等探究；并且进一步强调了 FANCI 介导的 R 环分布变化导致 LUAD 发展的因果作用。文章涉及的知识面很广，值得学习。最后，十分感谢作者提供了代码学习！！！
