Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system
这篇文章真的看了好久，就算一开始秉承着不求甚解的精神都看不下去，有太多的专业背景需求，直到昨天做完了T7 Endonuclease I digestion实验，回过头再来看这篇protocol文章，终于能明白了百分之七八十了。
但这篇文章长达29页，实在是不适合一页一页的翻看，看到后面前面已经忘记了，所以今天我将这篇文章的框架摘抄出来，整理如下：
ABSTRACT--略
INTRODUCTION--5个小标题
1. Precise genome editing using engineered nucleases
简单的背景介绍，说明精确编辑的重要性，有什么样的核酸酶。
2. Cas9: an RNA-guided nuclease for genome editing
详细介绍Cas9，并且介绍sgRNA。
3. Comparison with other genome editing technologies
简单的对比一下不同的基因编辑工具的优缺点，突出CRISPR-Cas9的优点
4. Limitations of the Cas9 system
简述CRISPR-Cas9的缺点
5. Experimental design
终于到实验设计部分了
(1) Target selection for sgRNA.
先确定要干嘛（敲除还是编辑），然后设计sgRNA
(2) Approaches for sgRNA construction and delivery.
确定sgRNA的表达方式，既然Cas9是需要sgRNA帮助来识别靶点的，那么sgRNA在细胞内该如何产生呢？这里提供了两种办法，PCR扩增法还有质粒表达法。
(3) Design of repair template.
这部分是设计模板，HDR（同源修复）有两种模板，一种是我们设计好插入到质粒中，另外一种呢是ssODN。想清楚选择哪一种。
(4) Clonal isolation of cell lines.
将带sgRNA表达的质粒或者载体+模板一起转染细胞，并且最后通过筛选标记分离（抗生素抗性或者荧光筛选）。
(5) Functional testing.
验证基因编辑的效果。
MATERIALS--实验材料和试剂
1. REAGENTs
sgRNA preparation, Mammalian cell culture, genotyping analysis
2. REAGENT SETUP
PROCEDURE--实验步骤
1. 确定要用什么材料，sgRNA还是ssODN
一般来说 sgRNA是帮助Cas9识别靶点，而Cas9造成DNA的双剑断裂（DSB）切口之后，DNA需要自我修复（DNA总不能一直断着吧）。
这时候呢，没有模板的就是易出错的同源修复，会造成缺失（敲除），那么有模板的呢，这部分模板就会接上去，就造成了插入，这就是我们常说的HDR。
那么说到HDR是需要模板的，模板又分为两种，一种呢是在质粒上的，另一种比较简单，是ssODN。
因此，首先要确定的是，到底是想做敲除呢，还是想做插入。
1.1 Design of targeting components and the use of the CRISPR Design Tool ● TIMING 1 d
1.2 Design of the ssODN template (optional) ● TIMING 1 h
2. 确定好之后开始action
Preparation of sgRNA expression construct，因为我们要做的是敲除，并且选择了质粒sgRNA的方法，所以首先要设计sgRNA，并将sgRNA插入到质粒中
(A) Generation of the sgRNA expression construct by PCR amplification ● TIMING 2 h
(B) Cloning sgRNA into the pSpCas9(BB) vector for co-expression with Cas9 ● TIMING 3 d
3. 功能测试
第一部分自然是先转染细胞，将材料都转进去。
Functional validation of sgRNAs: HEK 293FT cell culture and transfections ● TIMING 3–4 d** 先拿293FT细胞做转染验证
Co-transfection of CRISPR plasmids and HDR templates into HEK 293FT cells (optional) ● TIMING 3–4 d** 这是我们前面提到的，如果要做HDR修复的话，那就需要模板，需要将质粒和模板共转。
hESC (HUES 9) culture and transfection ● TIMING 3–4* 因为多能干细胞和普通细胞的转染是不一样的，所以单独放出来给大家参考。
第二部分就是我们说的筛选细胞
Isolation of clonal cell lines by FACS ● TIMING 2–3 h hands-on; 2–3 weeks expansion 通过荧光筛选细胞的实验步骤。
Isolation of clonal cell lines by dilution ● TIMING 2–3 h hands-on; 2–3 weeks expansion 通过挑单克隆的方法筛选
第三部分就是编辑效果
Functional testing: detection of indel mutations by the SURVEYOR nuclease assay ● TIMING 5–6 h 通过SURVEYOR核酸酶实验验证效果，这部分我没有用这个酶，我们用的是T7 Endonuclease I，这个酶可以识别DNA上错配的地方，然后给切开。
Functional testing: detection of genomic microdeletions by PCR ● TIMING 3–4 h hands-on; 2–3 weeks expansion 通过PCR实验验证删除和倒置。
(A) Deletion or microdeletion analysis
(B) Inversion analysis
Functional testing: genotyping of HDR-mediated targeted modifications by restriction-fragment length polymorphism (RFLP) analysis ● TIMING 3–4 h 限制性片段长度多态性验证HDR介导的基因编辑结果。这个名词好长，看起来不好理解，实际上就是，不好理解。可以自行百度一下就知道了。
Assessment of Cas9 cleavage or HDR-mediated target modification efficiency by Sanger sequencing ● TIMING 3 d 测序验证
Deep sequencing and off-target analysis ● TIMING 2–3 d 脱靶效应
总览
思路图
