• 发表时间：2023/5/10

• 发表期刊：Cell Host & Microbe

  
  
  Graphical Abstract

要点

• Chlorotonil A (ChA)对艰难拟梭菌（Clostridioides difficile）有抑制活性
• ChA 在小鼠模型中预防复发性艰难梭菌感染
• 不同于万古霉素，ChA处理后仍可保留对艰难梭菌的定植抗性
• ChA 保留在艰难梭菌孢子中，防止营养细胞生长

艰难梭菌背景：

引用：

https://www.chinagut.cn/articles/ss/311af3dd52bd460a9db160c54a766b80?kf=weekly
https://www.mayoclinic.org/zh-hans/diseases-conditions/c-difficile/symptoms-causes/syc-20351691
概括：

• 艰难梭菌（Clostridioides difficile）是一种可形成孢子的厌氧性梭菌属细菌。
• 艰难梭菌以休眠状态（Germination）存在于任何环境中。
• 艰难梭菌可在小肠中接触到初级胆汁酸后开始繁殖 （Vegetative Cells）；当艰难拟梭菌到达大肠（结肠）时，会释放破坏组织的毒素 （ TcdA， Tcd， Cdt）。
• 可形成具有高度传染性和耐受力的孢子（Spore），并通过粪口途径传播。
• 抗生物使用导致肠道菌群变化，改变对艰难梭菌的定植抵制，使得艰难梭菌滋生，是艰难梭菌感染（CDI）的主要原因之一。
• CDI 通常采用抗生素治疗，然而多达 20% 的 CDI 患者会再次患病 （rCDI）。

研究意义：

找到一种抗生物，靶向杀死艰难梭菌，且对肠道菌群较小影响，可以保留对艰难梭菌的定植抵制，减少rCDI

研究基础：

• Chlorotonil A (ChA)，一种萜类化合物，报道对革兰氏阳性菌有抑制活性
• ChB1-Epo2是ChA的一种衍生物，较ChA有更强的水溶性，体内活性
  因此作者推测ChA是对艰难梭菌有窄谱活性

结果：

Chlorotonils对不同Clostridioides difficile菌株有抗菌活性

Figure 1

• 测试ChA和ChB1-Epo2对八株Clostridioides difficile（四株对特定抗生素有抗性）的抑制效果
• ChA和ChB1-Epo2对Clostridioides difficile的抑菌效果和常用的抗生物类似
• 根据杀菌抗生素的经典定义，即 MIC 与 MBC 的比值 < 4，将这两种 chlorotonils 归类为杀菌剂。

ChB1-Epo2 在亚致死浓度下强制代谢重编程和扰乱金属稳态

为了进一步解决亚致死浓度下的生理和生化变化，测定了艰难梭菌菌株 630 的转录对ChB1-Epo2处理的反应。

• 艰难梭菌生长至指数中期，并用 4.7 ng/mL ChB1-Epo2 处理 30 分钟（亚致死浓度，致死浓度为0.8 ug/mL, 170x?），会导致显着的生长延迟。 DMSO 处理的细胞用作对照（ChA、ChB1-Epo2、 fidaxomicin、metronidazole溶解在DMSO中，vancomycin溶解于水中）。
• 转录组分析，大量上调基因属于能量产生和转换以及细胞壁生物发生的类别。
• 病原体对 ChB1-Epo2 的反应主要表现为能量、AA 和碳水化合物代谢的剧烈重编程，大分子和多胺合成的减少，以及应激反应相关基因转录物丰度的增加。
• 蛋白质组分析90分钟亚致死浓度处理的病菌。在 32 种高丰度和 ON 蛋白中，预计有 11 种会在其保守的半胱氨酸上结合瞬态金属或铁硫簇。

• 电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) 分析法分析了经 ChB1-Epo2 处理的细胞和未经处理的细胞的金属含量。 ICP-MS 结果表明二价阳离子铜、锌和镉显着增加。

  
  
  Figure 2

ChA成功地对抗已建立的 CDI 并防止复发感染

基于克林霉素诱导的微生物群破坏，构建小鼠感染模型

Figure 3

• 老鼠建模（Figure 3A）, 40 mg/kg ChA, 40 mg/kg ChB1-Epo2, or 20 mg/kg vancomycin处理两天。第 2 天后停止抗生素治疗，以监测抗菌作用的持久性，并出现复发性感染的可能性。
• 感染后 24 小时（第 1 天），小鼠体重严重下降（Figure 3B），表明该病发病迅速。
• 在第二次给药后的几天内，两组中大多数接受万古霉素和 ChA 治疗的小鼠开始恢复至 66.6% 的最终存活率（6/9 小鼠）。 但是经 ChB1-Epo2 处理的小鼠开始死于感染，最后生存率为22.2%（2/9 小鼠），与载体处理的对照组相同。
• 万古霉素处理老鼠，体重先增加后降低，可能存在复发感染。ChA 治疗的小鼠体重稳定增加，无复发感染。
• 在第五天时， 万古霉素治疗老鼠体内Clostridioides difficile的数量显著高于ChA治疗的老鼠。lipocalin-2（典型的肠道炎症的标志物）和产生的毒素的浓度也显著高于ChA治疗的老鼠。
• 持续检测粪便样本中ChA和万古霉素浓度（Figure 3G）。万古霉素在第三天后不能检测出，而ChA在第五天仍可检测出。证明ChA在体内持续时间更久。
• 为了测试持续的 ChA 水平是否足以调节体内 CDI 的发展，用克林霉素 (10 mg/kg) 和 ChA (40 mg/kg) 或豆油（作为对照）预处理 SPF 小鼠，然后进行CDI测试。 与对照组相比，ChA 预处理导致疾病发作显着减慢且严重程度较轻，其特征是体重减轻减少和存活率更高。
• 用艰难梭菌感染无菌 (GF) 小鼠，然后用艰难梭菌感染 抗生素治疗。 无论接受何种治疗，我们都观察到严重的体重减轻（Figure 3I），导致注射后第 2 天的死亡率为 100% (7/7)。 因此，无论是 ChA 还是万古霉素都无法成功预防 GF 小鼠的 CDI，这表明恢复中的微生物群在成功治疗 CDI 中具有生理相关的贡献。

这些结果表明，持续使用 ChA 能够长时间拮抗艰难梭菌，从而促进清除。

在小鼠中，与 ChB-Epo2 和万古霉素相比，ChA 诱导明显的微生物群变化

Figure 4

• 在治疗第三天，ChB-Epo2 和万古霉素处理的老鼠菌群有很大差别（Figure 4A）
• 在治疗第三天，万古霉素处理后alpha-diversity更低，对菌群影响更大 （Figure 4B）。
• 为探究ChA对菌群的单独影响，不对老鼠进行抗生物预处理及感染。用两种浓度（40 和 20 mg/kg）的单次口服剂量的 ChA 或 ChB1-Epo2 治疗小鼠（Figure 4D）。 在不同时间点（第 0、1、3、5 和 7 天）从同一只小鼠纵向收集粪便样本。
• ChA 和 ChB1-Epo2 暂时降低了观察到的物种丰富度和香农多样性指数。

与 ChB1-Epo2 或万古霉素相比，ChA 对微生物群产生明显且不太严重的变化

ChA对仔猪微生物群的影响很小

Figure 5

• 与啮齿动物相比，猪模型在遗传学、生理学和微生物群组成方面与人类具有更多相似性
• 在第二次抗生素治疗之前（第 0 天）和 6 小时后（第 1 天）以及接下来的 3 天（第 2、3 和 4 天），从每只动物身上采集粪便样本（未使用艰难梭菌感染）。
• 随着时间的推移，粪便样本的多样性没有显着变化
• 通过流式细胞术确定粪便中细菌绝对丰度，定量细菌细胞数量在样本、个体和时间点之间存在显着差异，即使在对照组中也是如此（Figure 5C）

Chlorotoxin 治疗维持肠道新陈代谢并保持对抗艰难梭菌的天然 CR

Figure 6

• 测定比较24小时抗生物处理之后的代谢组 （Figure 6A、B、C）
• ChA 或 ChB1-Epo2 (40 mg/kg)，或克林霉素 (10 mg/kg) 或万古霉素 (20 mg/kg) 作为对照，然后第二天感染艰难梭菌 VPI10463孢子 （Figure 6D）。
• 克林霉素和万古霉素处理的小鼠在注射后 1 天开始体重急剧下降，表明这两种抗生素都会破坏 CR 并导致对 CDI 的易感性（Figure 6E）。 ChA 和 ChB1-Epo2 治疗均未导致表型疾病。

这些结果表明，与万古霉素和克林霉素不同，ChA 和 ChB1-Epo2 对与艰难梭菌共享营养生态位或产生 CR 相关代谢物的共生细菌表现出较小的有害作用，从而保持 CR 对艰难梭菌的完整性。

ChA 和ChB1-Epo2 （较小程度）抑制艰难梭菌孢子生长到营养细胞中

Chlorotonils 持续存在于 C. difficile 孢子上并防止小鼠的致死性感染

Figure 7