基本分析
在本节中，我们将使用immunarch包中的基本函数对免疫组库数据进行常规分析。
常用函数如下：
-
repExplore- 计算基本统计数据，例如克隆数或长度和计数的分布。要探索它们，您需要将统计信息如“count”传递给.method参数. -
repClonality- 计算TCR/BCR库的克隆性。 -
repOverlap- 计算不同TCR/BCR库的重叠性。 -
repOverlapAnalysis- 分析TCR/BCR库的重叠，包括不同的聚类程序和 PCA。 -
geneUsage- 计算V或J基因的分布。 -
geneUsageAnalysis- 分析V或J基因的分布，包括聚类和PCA。 -
repDiversity- 估计TCR/BCR库的多样性。 -
trackClonotypes- 分析跨时间点的TCR/BCR库动态。 -
spectratype- 计算克隆型的谱型。 -
getKmers和kmer_profile- 计算 kmers 和序列配置文件的分布。
可视化分析结果
在immunarch中，每个函数的分析结果都可以直接传递给vis函数进行可视化，它是一个通用的可视化函数。同时，我们还可以通过.by参数传递任一分组变量，或同时将.by和.meta参数传递给 vis函数来进行分组展示。
- 我们可以通过
.by参数将元数据表中的一个或多个列名称作为字符向量传递，以便在绘图之前对数据进行分组。在这种情况下，您还应该提供.meta元数据表的参数。
- 我们可以通过
exp_vol <- repExplore(immdata$data, .method = "volume")
# Sample Volume
# A2-i129 A2-i129 6443
# A2-i131 A2-i131 6375
# A2-i133 A2-i133 6300
# A2-i132 A2-i132 6721
# A4-i191 A4-i191 5058
# A4-i192 A4-i192 5763
p1 <- vis(exp_vol, .by = c("Status"), .meta = immdata$meta)
p2 <- vis(exp_vol, .by = c("Status", "Sex"), .meta = immdata$meta)
# p1 + p2
image.png
- 我们还可以将
.by字符向量作为与数据中样本数量完全匹配的字符向量传递，每个值应对应于一个样本的属性。它将用于根据提供的值对数据进行分组。请注意，在这种情况下，您应该将 NA 传递给.meta.
- 我们还可以将
exp_vol <- repExplore(immdata$data, .method = "volume")
by_vec <- c("C", "C", "C", "C", "C", "C", "MS", "MS", "MS", "MS", "MS", "MS")
p <- vis(exp_vol, .by = by_vec)
p
image.png
当数据被分组后，immunarch包会默认执行组间均值比较的统计检验，除非设置参数.test = F。如果只有两个组，则执行Wilcoxon 秩和检验（wilcox.test带有参数的R 函数exact = F）以测试两组之间的平均秩值是否存在差异。如果有两个以上的组，则执行Kruskal-Wallis 检验（R 函数kruskal.test），这相当于秩合方差分析，它测试来自不同组的样本是否来自同一分布。一个显著的 Kruskal-Wallis 检验结果表明至少一个样本随机地支配另一个样本。多重比较调整后的 P 值绘制在组的顶部。P 值调整是使用Holm 方法（也称为 Holm-Bonferroni 校正）。您可以[?p.adjust](https://rdrr.io/r/stats/p.adjust.html)在 R 控制台中执行该命令以查看更多信息。
该vis函数生成的图以及任何基于 ggplot2 的图都可以传递给 —fixVis内置交互式可视化工具，用于制作可发表的图：
# 1. Analyse
exp_len <- repExplore(immdata$data, .method = "len", .col = "aa")
# Sample Length Count
# 1 A2-i129 6 1
# 2 A2-i129 9 6
# 3 A2-i129 10 36
# 4 A2-i129 11 243
# 5 A2-i129 12 517
# 6 A2-i129 13 1081
# 2. Visualise
p1 <- vis(exp_len)
# 3. Fix and make publication-ready results
fixVis(p1)
image.png
探索性可视化分析
对于基本的探索性分析，例如比较每个曲目的读取数/UMI 或分布，请使用该函数repExplore。
exp_len <- repExplore(immdata$data, .method = "len", .col = "aa")
head(exp_len)
# Sample Length Count
# 1 A2-i129 6 1
# 2 A2-i129 9 6
# 3 A2-i129 10 36
# 4 A2-i129 11 243
# 5 A2-i129 12 517
# 6 A2-i129 13 1081
exp_cnt <- repExplore(immdata$data, .method = "count")
head(exp_cnt)
# Sample Clone.num Clonotypes
# 1 A2-i129 1 5858
# 2 A2-i129 2 388
# 3 A2-i129 3 86
# 4 A2-i129 4 26
# 5 A2-i129 5 25
# 6 A2-i129 6 6
exp_vol <- repExplore(immdata$data, .method = "volume")
head(exp_vol)
# Sample Volume
# A2-i129 A2-i129 6443
# A2-i131 A2-i131 6375
# A2-i133 A2-i133 6300
# A2-i132 A2-i132 6721
# A4-i191 A4-i191 5058
# A4-i192 A4-i192 5763
p1 <- vis(exp_len)
p2 <- vis(exp_cnt)
p3 <- vis(exp_vol)
p1
image.png
p2 + p3
image.png
# You can group samples by their metainformation
p4 <- vis(exp_len, .by = "Status", .meta = immdata$meta)
p5 <- vis(exp_cnt, .by = "Sex", .meta = immdata$meta)
p6 <- vis(exp_vol, .by = c("Status", "Sex"), .meta = immdata$meta)
p4
image.png
p5 + p6
image.png
克隆性分析
估计样本多样性的方法之一是评估克隆性。repClonality函数可以计算最频繁或最不常见的克隆型的数量。有几种方法可以评估克隆性，让我们来看看它们。该clonal.prop方法计算细胞克隆池占据的所有库的比例：
imm_pr <- repClonality ( immdata$data , .method = "clonal.prop" )
imm_pr
## Clones Percentage Clonal.count.prop
## A2-i129 18 10.0 0.0027556644
## A2-i131 28 10.0 0.0042728521
## A2-i133 9 10.3 0.0014077898
## A2-i132 113 10.0 0.0164987589
## A4-i191 4 11.5 0.0007773028
## A4-i192 8 10.4 0.0013738623
## MS1 2 10.1 0.0003700278
## MS2 66 10.0 0.0092372288
## MS3 2 10.6 0.0003095496
## MS4 176 10.0 0.0236336780
## MS5 3 13.2 0.0005303164
## MS6 150 10.0 0.0202456472
## attr(,"class")
## [1] "immunr_clonal_prop" "matrix"
该top方法考虑了最丰富的细胞克隆型：
imm_top <- repClonality(immdata$data, .method = "top", .head = c(10, 100, 1000, 3000, 10000))
imm_top
## 10 100 1000 3000 10000
## A2-i129 0.08011765 0.17282353 0.3491765 0.5844706 1
## A2-i131 0.06670588 0.15647059 0.3467059 0.5820000 1
## A2-i133 0.10505882 0.18294118 0.3655294 0.6008235 1
## A2-i132 0.02388235 0.09423529 0.3118824 0.5471765 1
## A4-i191 0.17176471 0.32047059 0.5122353 0.7475294 1
## A4-i192 0.11541176 0.22141176 0.4325882 0.6678824 1
## MS1 0.19164706 0.30894118 0.4817647 0.7170588 1
## MS2 0.04458824 0.11470588 0.2770588 0.5123529 1
## MS3 0.16482353 0.23011765 0.3575294 0.5928235 1
## MS4 0.02329412 0.07517647 0.2415294 0.4768235 1
## MS5 0.20611765 0.29188235 0.4521176 0.6874118 1
## MS6 0.02835294 0.08235294 0.2460000 0.4812941 1
## attr(,"class")
## [1] "immunr_top_prop" "matrix"
该rare方法处理丰度最低的克隆型：
imm_rare <- repClonality(immdata$data, .method = "rare")
imm_rare
## 1 3 10 30 100 MAX
## A2-i129 0.6991765 0.8215294 0.8710588 0.9267059 0.9604706 1
## A2-i131 0.6969412 0.8243529 0.8995294 0.9436471 0.9869412 1
## A2-i133 0.6800000 0.8100000 0.8690588 0.8974118 0.9357647 1
## A2-i132 0.7088235 0.8831765 0.9643529 0.9951765 1.0000000 1
## A4-i191 0.5355294 0.6484706 0.7189412 0.7707059 0.8697647 1
## A4-i192 0.5976471 0.7487059 0.8342353 0.8675294 0.9156471 1
## MS1 0.5780000 0.6692941 0.7438824 0.7929412 0.8571765 1
## MS2 0.7788235 0.8891765 0.9322353 0.9718824 1.0000000 1
## MS3 0.7272941 0.7825882 0.8071765 0.8385882 0.8652941 1
## MS4 0.8109412 0.9343529 0.9725882 1.0000000 1.0000000 1
## MS5 0.6112941 0.7001176 0.7575294 0.7809412 0.8284706 1
## MS6 0.8107059 0.9208235 0.9703529 0.9897647 1.0000000 1
## attr(,"class")
## [1] "immunr_rare_prop" "matrix"
最后，该homeo方法评估克隆空间稳态，即给定大小的克隆占据的TCR/BCR库的比例：
imm_hom <- repClonality(immdata$data,
.method = "homeo",
.clone.types = c(Small = .0001, Medium = .001, Large = .01, Hyperexpanded = 1)
)
imm_hom
## Small (0 < X <= 1e-04) Medium (1e-04 < X <= 0.001)
## A2-i129 0 0.8634118
## A2-i131 0 0.8858824
## A2-i133 0 0.8597647
## A2-i132 0 0.9542353
## A4-i191 0 0.7135294
## A4-i192 0 0.8183529
## MS1 0 0.7248235
## MS2 0 0.9244706
## MS3 0 0.8061176
## MS4 0 0.9683529
## MS5 0 0.7520000
## MS6 0 0.9625882
## Large (0.001 < X <= 0.01) Hyperexpanded (0.01 < X <= 1)
## A2-i129 0.09705882 0.03952941
## A2-i131 0.09011765 0.02400000
## A2-i133 0.07600000 0.06423529
## A2-i132 0.04576471 0.00000000
## A4-i191 0.15623529 0.13023529
## A4-i192 0.08611765 0.09552941
## MS1 0.12082353 0.15435294
## MS2 0.06411765 0.01141176
## MS3 0.05917647 0.13470588
## MS4 0.03164706 0.00000000
## MS5 0.07647059 0.17152941
## MS6 0.03741176 0.00000000
## attr(,"class")
## [1] "immunr_homeo" "matrix"
vis(imm_top) + vis(imm_top, .by = "Status", .meta = immdata$meta)
image.png
vis(imm_rare) + vis(imm_rare, .by = "Status", .meta = immdata$meta)
image.png
vis(imm_hom) + vis(imm_hom, .by = c("Status", "Sex"), .meta = immdata$meta)
image.png
