文章题目：CRISPR/Cas9全基因组筛选在生命科学中的应用

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文章链接：http://www.lifescience.net.cn/html/201809/20180911.htm#outline_anchor_4

选文原因：补充了很多基础知识点，把基础多夯一夯，总是没错的。

CRISPR/Cas9小知识点

1. 其实做生信的人都会知道，比对完成之后，挑选出CDS的gene，大约有2万多个，那么文题中提到的全基因组筛选，其实大部分就是在说这2W个gene。
2. 常用的全基因组筛选方法（自认为无法总结得更好，直接引用如下，做知识的搬运工）：

此前，常用的全基因组筛选方法由RNA干扰(RNA interfere, RNAi)和过表达cDNA文库介导，结合高通量测序分析，获得目的基因。RNAi是指体外合成的短链RNA，如shRNA (short hairpin RNA)^[4]、siRNA (small interfere RNA)^[5]通过碱基互补配对识别、降解mRNA，抑制基因翻译，导致基因功能性缺失(loss-of-function)^[6-9]，该方法已被广泛应用于基因功能研究^[10-11]。但是，RNAi无法完全抑制基因的转录或翻译，并且容易脱靶导致假阳性或假阴性结果^{[6, 12]}。过表达cDNA是指将编码基因的cDNA序列导入细胞内，提高蛋白质的翻译水平，产生功能激活(gain-of-function)效应。然而，真核生物基因转录后存在可变剪接，一个基因具有多种转录本，cDNA文库难以完全覆盖，只能揭示基因的部分功能^[13-14]。

3. 温故知新之CRISPR/Cas9原理

CRISPR/Cas9基因编辑系统由一个具有核酸内切酶功能的Cas9蛋白(或其他同源蛋白)和一条单链向导RNA (single guide, sgRNA)组成。sgRNA与Cas9蛋白结合靶向到基因组特定位点，Cas9切割产生双链断裂(double strand breaks, DSB)，经过细胞自主性的非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)或同源重组(homology- directed repair, HR)进行修复，引入突变。NHEJ是一种错配的修复机制，Ku70/80招募DNA连接酶IV到DSB位点，DNA连接时产生碱基插入或缺失突变。HR是指有同源臂供体存在的情况下，供体中的外源基因片段通过同源重组整合到靶位点，利用这一方法可以实现基因的原位矫正^[23]和遗传增强^[24]。已有研究表明，在细胞分裂的各个时期中，细胞自主发生NHEJ的频率高于HR^[25]，所以CRISPR/Cas9基因编辑常在靶位点产生碱基插入或缺失，导致基因功能失活。

这一段更加清晰明了的介绍了NHEJ和HR之间的不同，适合初学者补充背景知识，也能更直观的加强我对该系统的认知。

4. 核酸内切酶失活的Cas9 (nuclease-dead mutants of Cas9, dCas9)
   开始涉足CRISPR/Cas9背景知识之后，会遇到很多不同名字的Cas9，例如，iCas9，dCas9，CRISPRa，CRISPRi等等，了解他们之间的差别可以很大程度的扩展对CRISPR/Cas9用途的理解，可谓一举多得。

dCas9：失活Cas9，即核酸内切酶失活的Cas9 (nuclease-dead mutants of Cas9, dCas9)，能识别却不会切割。

（1）dCas9用于抑制基因表达

核酸内切酶失活的Cas9 (nuclease-dead mutants of Cas9, dCas9)融合或招募转录因子，作用在基因转录起始位点(transcription start sites, TSS)，调控基因转录。将dCas9与转录抑制因子KRAB (Krüppel-associated box)融合，特异性地抑制基因表达(CRISPR interference, CRISPRi)^[26-27]，干扰效率远高于RNAi。

(2) dCas9用于增强基因表达： dCas9可以将转录激活因子招募到TSS位点，促进基因转录激活(CRISPR activation, CRISPRa)^[28]

①VPR系统，将dCas9与VP64、p65激活结构域(NF-κB的亚基)和Rta (Epstein-Barr病毒R反式激活因子)融合表达，共同作用在TSS位点，促进基因转录^[29]；
②Sun-Tag系统，dCas9融合10个串联GCN4抗原，识别并结合scFv-sfGFP-VP64复合体，当VP64被招募到TSS位点时，基因转录被激活^[30-31]；
③SAM系统(synergistic activation mediator)，该系统由两部分组成，一部分表达dCas9-VP64复合体，并且转录sgRNA-MS2-hairpin (hairpin可识别并结合MS2)，另一部分表达MS2-p65-HSF1 (MPH v2, HSF1: human heat-shock factor 1)复合体，该复合体被MS2-hairpin招募到TSS位点，与VP64组成协同激活中间体(SAM)，促进基因转录^[32]。

事实上，这一段才是我看这篇文章的主要目的，主要是在阅读文献的过程中，发现有不明白的地方，因此回头补充基础知识，由此可知，这篇文章使用了dCas9的SAM系统促进基因表达，主要功臣为VP64反式激活结构域。

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5. 全基因组筛选工具：基于CRISPR/Cas9的library工具
敲重点

当sgRNA靶向单基因时，CRISPR可视为一种高效的基因编辑工具。但当sgRNA靶向全基因组序列时，CRISPR便升级为一种全基因组筛选的工具。基于CRISPR/Cas9筛选的一般流程如下(图 1)：
①构建靶向全基因组的基因敲除文库(genome-scale CRISPR-Cas9 knockout, GeCKO)或激活基因sgRNA文库；
②包装慢病毒文库；
③以低MOI (multiplicity of infection，通常为0.3)感染细胞，使sgRNA整合到细胞基因组上，随基因组DNA的复制而复制；
④用抗生素筛选出感染病毒的细胞；
⑤根据表型(耐药性、增殖能力、存活能力、标记基因等)选择细胞；
⑥提取细胞核基因组；
⑦建库，进行二代测序；
⑧利用生物信息学分析获得目的基因^[33-34]。

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好了，今天就暂时到这儿吧，拜拜。