概览
- Tophat回贴基因组
- Cufflinks拼接转录本
- Cuffmerge整合转录本
- Cuffdiff计算转录本表达量
- 使用R绘制热图
- 绘制维恩图
Tophat回贴基因组
首先，我们需要将reads回贴至基因组，Tophat首先利用Bowtie将reads回贴至基因组，然后就可以发现基因组上有reads堆叠区域，其可能是一个外显子。然后根据经典剪切点有AG、GT这样的剪切点标记，找到可能的剪切组合，最后将那些没有被回贴的reades建立索引，去和剪切点比对，以回贴跨越剪切点的reads。
基本的Tophat命令如下：
$ nohup tophat -p 16 -G /data/hg19_refSeq.gtf -o tophat/38/ data/hg19 data/SRR3101238_1.fastq data/SRR3101238_2.fastq >tophat/38.log &
$ nohup tophat -p 16 -G /data/hg19_refSeq.gtf -o tophat/41/ data/hg19 data/SRR3101241_1.fastq data/SRR3101241_2.fastq tophat/41.log &
其中，-p参数，代表程序使用的最大进程数，需要注意的是，只在bowtie过程中才使用多线程。-G指向基因组注释文件，-o代表输出文件，值得注意的是，如果有多个样本在同时运行，要注意将输出位置分离，否则结果会混合在一起！最后三个是必须参数，第一个指向bowtie的index文件，仅给出index的名字即可，第二和第三个参数是双端测序的两个fastq文件。该程序运行时间比较长，所以，将其放入后台同样也很重要，同时注意保存运行的日志。
Cufflinks拼接转录本
为了将第一步的获得的转录本进行拼接，同时计算其表达量，接下来使用Cufflinks来实现。基本命令如下：
$ nohup cufflinks -p 16 -u -g data/hg19_refSeq.gtf -o cufflinks/38 tophat/38/accepted_hits.bam > cufflinks/38.log &
$ nohup cufflinks -p 16 -u -g data/hg19_refSeq.gtf -o cufflinks/41 tophat/41/accepted_hits.bam > cufflinks/41.log &
同样的-p参数代表最大线程数，-g指向基因组注释文件，-o参数指向输出文件夹，同样需要注意会混杂的问题，不同的是，需要注意的是-u参数，其告诉程序需要使用更加准确的方法去处理贴到多个位点的reads，否则其程序只会平均分配reads。值得注意的是，-g有与之对应的-G参数，后者表示仅使用已知的基因注释，前者会试着拼接新的转录本。最后一个参数，指向tophat结果中对应的accepted_hits.bam文件。值得注意的是，该程序需要使用网络，请确保运行环境有联网环境，或者可以使用--no-update-check参数，但是在下一步的Cuffmege的过程中，不能联网的环境同样会使得程序阻塞。
Cuffmerge整合转录本
我们使用Cufflinks处理多个样本之后，我们需要将其转录本数据整合为一个全面的转录本集合，使得所有的转录本能够基于统一的标准。这里我们使用Cuffmerge，其基本命令如下：
nohup cuffmerge -g data/hg19_refSeq.gtf -s data/hg19.fa -p 16 -o cuffmerge cuffmerge/assemblies.txt > cuffmerge/run.log &
此处的-p、-g、-o与前面都相同，-s指向基因组fasta文件。需要注意的是，该基因组，与前面bowtie的index，以及注释文件，都必须是一致的数据源！最后的assemblies.txt是自己创建的，其内容为需要合并的转录本文件（即tophat结果文件中的transcripts.gtf文件）路径，大致内容如下：
../cufflinks/38/transcripts.gtf
../cufflinks/41/transcripts.gtf
可以使用相对路径，但保险起见，建议使用绝对路径。如前面所说，该程序需要联网的环境，否则程序将阻塞！
Cuffdiff计算转录本表达量
最后，我们根据已经合并的转录本获得其表达量差异，其原理即read数量与对应转录本数量成正比，通过对reads进行计数计算转录本表达量即可，同时Cuffdiff还将给出不同转录本的表达水平的显著性差异。Cuffdiff的基本，命令如下：
$ nohup cuffdiff -o cuffdiff -p 16 -L 41,38 -u cuffmerge/merged.gtf tophat/41/accepted_hits.bam tophat/38/accepted_hits.bam >runlog.log &
这其中的-o、-p参数与前面一致，-L表示给多个样本添加的标记，每个样本标记之间用逗号隔开，-u参数指向Cuffmerge结果文件中的merged.gtf文件。最后的参数指向Tophat结果中的accepted_hits.bam文件，要注意其样本顺序与标记顺序一致，同一标志下的样本多次实验结果之间用逗号隔开（此处并没有多次重复使用的样本）。该程序同样需要联网的环境。
使用R绘制热图
通过以上步骤，我们已经得到了不同基因之间的表达差异，然后我们可以利用R对结果进行可视化，编写脚本代码如下
# @File: gene_exp.R
# @Author: yangmqglobe
# @Date: 2016.11.17
# 导入pheatmap包,需要提前安装
library(pheatmap)
arg = commandArgs()
# 根据获取的参数，读取文件
gene_exp = read.table(arg[6],header = TRUE)
# 筛选数据并排序
gene_exp = gene_exp[gene_exp$value_1>=1&gene_exp$value_2>=1,10]
gene_exp = sort(gene_exp)
# 绘制图片
png(paste(arg[6],'.png',sep = ''))
pheatmap(gene_exp,
cluster_rows = F,
cluster_cols = F,
color = colorRampPalette(rev(c("red","black","green")))(100),
cellwidth =20,
cellheight = NA)
off = dev.off()
cat(paste('save:',arg[6],'.png',sep = ''))
脚本依赖pheatmap包，需要提前安装，接下来运行：
$ Rscript gene_exp.R cuffdiff/gene_exp.diff
当前文件夹下将生成基因表达热图如下所示
绘制韦恩图
结合上次Chip-seq分析的结果，可以绘制韦恩图来展示super-enhancer对于基因表达的影响。编写脚本代码如下：
# 用于生成维恩图
library(VennDiagram)
arg = commandArgs()
gene_diff = read.table(arg[6],head=TRUE)
gene_superenhancer = read.table(arg[7],head=TRUE)
gene_diff = gene_diff[gene_diff$value_1>=1,]
gene_diff = gene_diff[gene_diff$value_2>=1,]
gene_diff = gene_diff[abs(gene_diff$log2.fold_change.)>=1,3]
gene_superenhancer = gene_superenhancer[gene_superenhancer$IS_SUPER==1,2]
len_gene_diff = length(gene_diff)
len_gene_superenhancer = length(gene_superenhancer)
len_same = length(intersect(gene_diff,gene_superenhancer))
t = venn.diagram(list(DIFF=gene_diff,SUPER=gene_superenhancer),
filename = NULL,
lwd=1,
lty=2,
col=c('red','green'),
fill=c('red','green'),
cat.col=c('red','green'))
png('result.png')
grid.draw(t)
off = dev.off()
whole = calculate.overlap(list(gene_diff,gene_superenhancer))
write.table(whole$a3,file="overlap",quote=FALSE,row.names = FALSE)
cat('done!')
使用时如下：
$ Rscript venn.R gene_exp.diff chip_seqresult
将自动在当前文件夹下生成维恩图，如图
同时给出相应基因的ID在overlap文件内。
