scATAC分析神器ArchR初探-ArchR进行doublet处理（2）

2-使用ArchR进行双胞推断

单元格数据中的主要问题来源之一是“双胞”对分析的贡献。双胞是指接收单个条形码珠和一个以上核的单个液滴。这导致从多个单元读取的读数显示为单个单元，实际上是两个单元的平均值。我们将以计算方式删除这些内容，并在本章中深入描述此doublet删除过程。

2.1双重识别在ArchR中如何工作？

基本上在任何平台上生成的单细胞数据都容易出现双胞。双胞是指接收单个条形码珠和一个以上核的单个液滴。这将导致从多个单元格读取的数据显示为单个单元格。对于10倍，实际上是双胞的“细胞”总数的百分比与加载到反应中的细胞数成正比。即使在使用标准试剂盒导致双胞水平较低的情况下，也可能有超过5％的数据来自双胞，这对聚类产生了重大影响。这个问题在发育/轨迹数据的背景下变得特别成问题，因为双胞看起来像是两种细胞类型之间的混合物，并且这可能与中间细胞类型或细胞状态混淆。

为了预测哪些“单元格”实际上是双胞，我们通过混合来自数千个单个细胞组合的读数，从数据中合成计算机双胞。然后，我们将这些合成双胞投影到UMAP嵌入中，并确定它们的最近邻居。通过重复执行数千次此过程，我们可以识别数据中的“单元”，其信号看上去与合成双胞相似。

为了开发和验证ArchR的双重识别，我们从10种遗传上不同的细胞系的混合混合物中生成了scATAC-seq数据。在scATAC-seq空间中，这10个细胞系应形成10个不同的簇，但是当我们故意使10x Genomics scATAC-seq反应超载，每个反应靶向25,000个细胞时，我们会得到许多双胞。我们知道这些是双胞，因为我们使用Demuxlet识别包含两种不同细胞类型的基因型的液滴。

这个“基本事实”与上面所示的双胞预测非常强烈地重叠，显示出接收器工作特性曲线下的面积> 0.90。

在用ArchR计算移除这些双胞后，我们数据的整体结构发生了巨大变化，并符合我们对10种不同细胞类型的期望。

2.2使用 ArchR推断scATAC-seq双胞

默认情况下，ArchR使用ArchR手稿中描述的doublet参数。这可能是一个不错的起点，但我们鼓励所有用户检查双倍体去除前后的数据，以了解双倍体去除对细胞的影响。我们在下面显示一些主要的可调节功能，以说明如何针对给定应用定制此功能。

在ArchR中，使用可以在一个步骤中完成双胞删除addDoubletScores()。这会将推断的双胞得分添加到每个Arrow文件中，每个教程数据样本大约需要2-5分钟。您始终可以尝试?addDoubletScores查看有关用于doublet识别的参数（或与此相关的任何ArchR函数）的更多文档。

doubScores <- addDoubletScores(
    input = ArrowFiles,
    k = 10, #Refers to how many cells near a "pseudo-doublet" to count.
    knnMethod = "UMAP", #Refers to the embedding to use for nearest neighbor search with doublet projection.
    LSIMethod = 1
)

ArchR记录到：ArchRLogs / ArchR-addDoubletScores-e60f2395c3f7-Date-2020-04-15_Time-09-28-44.log
如果有问题，请使用logFile向github报告！
2020-04-15 09:28:44：批量执行w / safelapply !，已过去0分钟。
2020-04-15 09:28:44：scATAC_BMMC_R1（3之1）：计算Doublet统计信息，已过去0.001分钟。
scATAC_BMMC_R1（3之1）：UMAP投影R ^ 2 = 0.9736
scATAC_BMMC_R1（3之1）：UMAP投影R ^ 2 = 0.9736
2020-04-15 09:31:15：scATAC_CD34_BMMC_R1（2之3 ）：计算Doublet统计信息，已过去2.511分钟。
scATAC_CD34_BMMC_R1（2之3）：UMAP投影R ^ 2 = 0.99046
scATAC_CD34_BMMC_R1（2之3）：UMAP投影R ^ 2 = 0.99046
2020-04-15 09:32:40：scATAC_PBMC_R1（3之3）：计算Doublet统计信息，已过去3.936分钟。
scATAC_PBMC_R1（3 of 3）：UMAP投影R ^ 2 = 0.97507
scATAC_PBMC_R1（3 of 3）：UMAP Projection R ^ 2 = 0.97507
ArchR成功登录到：ArchRLogs / ArchR-addDoubletScores-e60f2395c3f7-Date-2020 -04-15_Time-09-28-44.log

在上面的输出中，ArchR报告每个Arrow文件的UMAP投影的R ²值。如果这些R ²值低得多（即小于0.9），则通常表明Arrow文件中的单元格具有很少的异质性。这会使doublet调用的准确性变差，因为doublets的大多数将是“同型的”-或具有两个非常相似的单元的单个液滴。在这些情况下，我们建议跳过双胞预测。或者，您可以尝试设置knnMethod = "LSI"并force = TRUE在LSI子空间中执行投影；但是，您应该手动评估结果，并确保其效果符合预期。

添加双峰得分将在“ QualityControl”目录中创建图。此文件夹中的每个样本都有3个图：

双胞富集 -如果我们假设分布均匀，则表示与预期单元格相比，每个单个单元格附近模拟双胞的富集。
Doublet分数 - -log10(binomial adjusted p-value)如果我们假设分布均匀，则表示与预期相比，每个单元格附近模拟Doublet的显着性（）。我们发现此值不如doublet富集一致，因此使用doublet富集进行doublet鉴定。
双峰密度 -表示模拟的双胞投影的密度。这样一来，您就可以直观地看到合成二重体在投影到二维嵌入物中后的位置。

对于BMMC：

对于CD34 BMMC：

对于PBMC：

参考材料：

https://www.archrproject.com/