导读
humann中有一个模块可以进行基因物种来源分析，但是内部怎么分析的。如果能获得每个物种的基因序列文件，那么不用humann也能进行此分析。所以基因BIN来源分析很适合Binning下游分析。
一、合并基因序列ffn文件
mkdir Bin_all/Bin_gene
touch Bin_all/Bin_gene/bin.ffn
echo -e "\033[32m 合并bin.ffn基因序列文件 begin: \033[0m"
for i in Bin_all/Bin_prokka/bin.*; do
fold=${i##*/}
cat ${i}/${fold}.ffn >> Bin_all/Bin_gene/bin.fa
echo -e "\033[32m add ${i}/${fold}.ffn to bin.fa OK\033[0m"
done
echo -e "\033[32m 合并bin.ffn基因序列文件 done... \033[0m"
二、cd-hit去冗余
官网：http://weizhongli-lab.org/cd-hit/
conda 地址：https://anaconda.org/bioconda/cd-hit
参数
M：内存，单位M，默认800
T：线程，默认1
c: identity 0.9 by default
# 安装
conda install -c bioconda cd-hit
cd-hit --help
# CD-HIT version 4.8.1 (built on Apr 7 2021)
echo -e "\033[32m redundant bin.ffn begin: \033[0m"
cd-hit -i Bin_all/Bin_gene/bin.ffn \
-o Bin_all/Bin_gene/out.fa \
-M 400000 \
-T 58 \
-c 0.9
echo -e "\033[32m redundant bin.ffn done... \033[0m"
bin.ffn 260M 但是去冗余后的out.fa也有259M。效果不明显默认的identity(-c)是0.9，调整到0.5-0.9之间的话去冗余效果肯定会更加明显。为了后期能进行基因/物种来源分析不再使用去冗余，主要因为合并bin 基因数并不多，经测试259M2小时搞定基因TPM计算，并不长
参考：
CD-hit安装及使用
三、salmon计算基因TPM
Salmon(硅鱼)是一款新的、极快的转录组计数软件，也被用于宏基因组bin定量(metawarp_quant)。这里我用salmon计算所有bin中预测基因的TPM。
文献：Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression
杂志：Nature Methods
时间：2017
Github: https://salmon.readthedocs.io/en/latest/salmon.html
1 构建salmon index
echo -e "\033[32m 构建合并bin基因序列文件salmon索引 begin: \033[0m"
salmon index -t Bin_all/Bin_gene/bin.fa \
-i Bin_all/Bin_gene/bin_index \
--type quasi -k 31 -p 58
echo -e "\033[32m 构建合并bin基因序列文件salmon索引 done... \033[0m"
参数：
-t [ --transcripts ] arg Transcript fasta file
-i [ --index ] arg salmon index
--type arg (=quasi) The type of index to build; the only option is
"quasi" in this version of salmon
-k [ --kmerLen ] arg (=31) The size of k-mers that should be used for the
quasi index
2 计算基因TPM
echo -e "\033[32m salmon计算去合并bin基因丰度 begin: \033[0m"
for i in Bin_all/Clean_data/*_1.fastq; do
file=${i##*/}
base=${file%_1.fastq}
salmon quant --libType A \
-i Bin_all/Bin_gene/bin_index \
-1 $i \
-2 Bin_all/Clean_data/${base}_2.fastq \
-o Bin_all/Bin_gene/${base}.quant -p 58
echo -e "\033[32m salmon $base done... \033[0m"
done
echo -e "\033[32m salmon计算合并bin基因TPM done... \033[0m"
其中的quant.sf文件就是我所需的所有 bin 基因在此样品中的TPM。所以的样品计算完成后通过合并TPM表可得到样品-bin-基因总TPM表。将在以后的博文中继续分享。
3 quant.sf合并
同事合并两组salmon丰度计算结果
# 合并 salmon_1 salmon_2
cat salmon_1/A10_quant.sf | awk -F"\t" '{print $1}' > merge1.out
cat salmon_2/A10_quant.sf | awk -F"\t" '{print $1}' > merge2.out
for i in `ls salmon_1/`;
do
base=${i%_quant.sf}
cat salmon_1/$i | sed 's/TPM/'$base'/' | awk -F"\t" '{print $4}' > add1.out
cat salmon_2/$i | sed 's/TPM/'$base'/' | awk -F"\t" '{print $4}' > add2.out
paste merge1.out add1.out > tmp1.out
paste merge2.out add2.out > tmp2.out
rm add1.out
rm add2.out
rm merge1.out
rm merge2.out
mv tmp1.out merge1.out
mv tmp2.out merge2.out
echo -e "$i done..."
done
参考：
不比对快速估计基因丰度Salmon
FPKM、TPM数据标准化
https://salmon.readthedocs.io/en/latest/salmon.html
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/021592v3
FPKM / RPKM与TPM哪个用来筛选差异表达基因更准确？你可别逗了！
TPM可以认为是相对丰度，同一样本内总和为1。
python小脚本：重复行合并求和
python——将大文件切分为多个小文件
