差异分析的套路都是差不多的，大部分设计思想都是继承limma这个包，DESeq2也不例外。
DESeq2是DESeq包的更新版本，看样子应该不会有DESeq3了，哈哈，它的设计思想就是针对count类型的数据。
可以是任意features的count数据，比如对各个基因的count，或者外显子，或者CHIP-seq的一些feature，都可以用来做差异分析。
使用这个包也是需要三个数据：
- 表达矩阵
- 分组矩阵
- 差异比较矩阵
总结起来三个步骤，我下面会一一讲解
- 重点就是构造一个dds的对象，
- 然后直接用DESeq函数进行normalization处理即可，
- 处理之后用results函数来提取差异比较结果。
读取自己的数据
一般我们会自己读取表达矩阵和分组信息，下面是一个例子：
1. options(warn=-1)
2. suppressMessages(library(DESeq2))
3. suppressMessages(library(limma))
4. suppressMessages(library(pasilla))
5. data(pasillaGenes)
6. exprSet=counts(pasillaGenes)
7. head(exprSet) ##表达矩阵如下
8. ## treated1fb treated2fb treated3fb untreated1fb untreated2fb
9. ## FBgn0000003 0 0 1 0 0
10. ## FBgn0000008 78 46 43 47 89
11. ## FBgn0000014 2 0 0 0 0
12. ## FBgn0000015 1 0 1 0 1
13. ## FBgn0000017 3187 1672 1859 2445 4615
14. ## FBgn0000018 369 150 176 288 383
15. ## untreated3fb untreated4fb
16. ## FBgn0000003 0 0
17. ## FBgn0000008 53 27
18. ## FBgn0000014 1 0
19. ## FBgn0000015 1 2
20. ## FBgn0000017 2063 1711
21. ## FBgn0000018 135 174
22. (group_list=pasillaGenes$condition)
23. ## [1] treated treated treated untreated untreated untreated untreated
24. ## Levels: treated untreated
25. ##这是分组信息，7个样本，3个处理的，4个未处理的对照！
第一步：构建dds对象
那么根据这两个数据就可以构造dds的对象了
1. colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet),
2. group_list=group_list
3. )
4. ## 这是一个复杂的方法构造这个对象！
5. dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,
6. colData = colData,
7. design = ~ group_list)
9. ## design 其实也是一个对象，还可以通过design(dds)来继续修改分组信息，但是一般没有必要。
10. dds
11. ## class: DESeqDataSet
12. ## dim: 14470 7
13. ## exptData(0):
14. ## assays(1): counts
15. ## rownames(14470): FBgn0000003 FBgn0000008 ... FBgn0261574
16. ## FBgn0261575
17. ## rowData metadata column names(0):
18. ## colnames(7): treated1fb treated2fb ... untreated3fb untreated4fb
19. ## colData names(1): group_list
可以看到我们构造的dds对象有7个样本，共14470features
从基因名可以看出，是果蝇的测序数据
我们也可以直接从expressionSet这个对象构建dds对象！
1. library(airway)
2. data(airway)
3. suppressMessages(library(DESeq2))
4. dds <- DESeqDataSet(airway, design = ~ cell+ dex)
5. design(dds) <- ~ dex
6. ## 构造好的对象还可以更改分组信息
第二步：做normalization
1. suppressMessages(dds2 <- DESeq(dds))
2. ##直接用DESeq函数即可
3. ## 下面的代码如果你不感兴趣不需要运行，免得误导你
4. ## 就是看看normalization前面的数据分布差异
5. rld <- rlogTransformation(dds2) ## 得到经过DESeq2软件normlization的表达矩阵！
6. exprSet_new=assay(rld)
7. par(cex = 0.7)
8. n.sample=ncol(exprSet)
9. if(n.sample>40) par(cex = 0.5)
10. cols <- rainbow(n.sample*1.2)
11. par(mfrow=c(2,2))
12. boxplot(exprSet, col = cols,main="expression value",las=2)
13. boxplot(exprSet_new, col = cols,main="expression value",las=2)
14. hist(exprSet)
15. hist(exprSet_new)
image.png
第三步：提取差异分析结果
1. resultsNames(dds2)
2. ## [1] "Intercept" "group_listtreated" "group_listuntreated"
3. ## 其实如果只分成了两组，并没有必要指定这个比较矩阵！
4. res <- results(dds2, contrast=c("group_list","treated","untreated"))
6. ## 提取你想要的差异分析结果，我们这里是trt组对untrt组进行比较
7. resOrdered <- res[order(res$padj),]
8. resOrdered=as.data.frame(resOrdered)
9. head(resOrdered)
10. ## baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue
11. ## FBgn0039155 453.2753 -4.281830 0.1919977 -22.30146 3.576174e-110
12. ## FBgn0029167 2165.0445 -2.182745 0.1080670 -20.19807 1.017931e-90
13. ## FBgn0035085 366.8279 -2.436860 0.1505280 -16.18875 6.054219e-59
14. ## FBgn0029896 257.9027 -2.511257 0.1823764 -13.76964 3.881667e-43
15. ## FBgn0034736 118.4074 -3.166392 0.2375506 -13.32933 1.562878e-40
16. ## FBgn0040091 610.6035 -1.526400 0.1278555 -11.93848 7.457520e-33
17. ## padj
18. ## FBgn0039155 2.764025e-106
19. ## FBgn0029167 3.933795e-87
20. ## FBgn0035085 1.559769e-55
21. ## FBgn0029896 7.500351e-40
22. ## FBgn0034736 2.415897e-37
23. ## FBgn0040091 9.606528e-30
差异分析结果很容易看懂啦！
