前言
据相关统计，胃癌 (GC) 在所有癌症中的发生率位居第五位，相关死亡率排第四位。大多数GC患者在诊断时已处于晚期并发生肿瘤转移，导致预后不佳，5年总生存率低于30%。因此，迫切需要找到用于早期诊断和治疗的特异性、敏感性预后相关分子标志物，并阐明GC发生和转移的分子机制。本研究旨在探索RECK作为预后分子标志物的潜力，并揭示其在肿瘤发生和转移中的潜在机制。
RECK（具有 Kazal 基序的富含半胱氨酸的回复诱导蛋白），是基质金属蛋白酶 (MMP) 的负性细胞表面调节剂，可以抑制恶性肿瘤行为（细胞增殖、侵袭和转移等），在大多数恶性肿瘤中的表达显著下调。之前的研究发现，在肝细胞癌中，RECK 的上调与高免疫原性和低血管状态呈正相关。在非小细胞肺癌中，RECK 通过介导受 miR221/22 调节的 Notch1 信号的激活来抑制癌症干细胞 (CSC) 的自我更新和维持，这些研究均表明 RECK 可能影响肿瘤免疫状态和 CSC 基因的表达。然而，目前研究者对GC 中RECK抗肿瘤作用的潜在分子机制了解有限。
在本研究中，作者通过收集不同数据集进行生物信息学分析，揭示了GC中RECK 表达的异常下降以及 RECK 的抗肿瘤作用，表明RECK可以作为GC患者良好预后的指标。另一方面，通过干湿结合深入探索了其背后的分子机制，表明 RECK 显著抑制肿瘤生长和 ERK/MAPK 信号介导的 EMT过程（上皮细胞-间充质转化）。
主要内容
（一）RECK 在胃腺癌（STAD）患者中低表达
首先，作者从TCGA数据库下载胃腺癌（STAD）、结肠腺癌（COAD）、食管癌（ESCA）和直肠腺癌（READ）的mRNA和miRNA转录组数据以及临床数据。从GEO数据库中下载GC数据集GSE26899、GSE66229、GSE84437、GSE13681、GSE54129、GSE15459、GSE34942 和 GSE26901。使用edgeR 包对TCGA-STAD的counts数据进行差异分析，得到总共4208个DEGs，其中RECK表达下调（图1A）。随后采用多种生物信息学分析方法（包括多组临床性状相关性分析、生存分析、ROC曲线），以P < 0.05为标准，从DEGs中筛选出RECK作为肿瘤相关候选基因。RECK与患者年龄、肿瘤分级、分期和STAD T分类显著相关（图1B）。此外，RECK 的ROC曲线下面积 (AUC) 值分别为 0.615、0.571 和 0.688(分别对应 1 年、3 年和 5 年生存率预测情况),其中5年生存率预测较为准确（图1C）。使用GSE13861 和 GSE28541 数据集检验RECK的AUC 值。TCGA-STAD 数据集生存分析的结果表明，较高的 RECK 表达与肿瘤I期相结合可预测较长的总生存期OS（图1D）。
此外，各数据集肿瘤和正常样本未配对、配对差异分析表明 RECK 在肿瘤样本中表达下调（图1E、F）。使用Oncomine数据库（图1H-I，该数据库已关闭）和 TIMER2.0 平台（图1G）进行RECK 表达水平的泛癌分析和meta分析，得出一致的结果。CPTAC数据库的胰腺癌蛋白数据集中，RECK 蛋白水平同样低表达（图1J）。使用AGS 和 HGC-27 细胞系进行RT-qPCR 和 Western blot实验，进一步验证RECK 在 STAD 中表达下调。（图1K、L）。
（二）RECK上调抑制侵袭性肿瘤，是GC患者的良好预后指标
作者发现在RECK低表达的患者中，管状型和增殖型GC的发生率增加（图2A，B）。使用COX 回归模型中的风险比 HR值（变量系数得出的 e 次方值），进一步筛选独立预后因素（HR > 1，该变量是危险因素；HR < 1，该变量是保护因素）。随后，通过进行单因素和多因素Cox回归分析，结果表明年龄（HR = 1.032）、肿瘤分期（HR = 1.556）和RECK表达（HR = 0.644）是胃癌患者总生存期的独立预后因素（p值均小于0.05，图2D）。作者进一步开发了三种对GC患者结局的预测模型：单独的RECK表达水平、单独的肿瘤分期以及整合RECK表达与分期。ROC曲线表明，单独RECK表达的预测模型准确性更高（AUC：0.688（图2E）。最后，作者使用列线图构建了一种更精确的 GC 患者总体生存预测的定量模型，该模型变量包括已证明的独立预后因素（年龄、分期和 RECK 表达）（图2G）。校准图显示该列线图预测 1 年和 5 年总生存率准确性较高（图2H）。以上结果表明 RECK 可能是一个很好的独立预后指标。
肿瘤细胞和干细胞之间的相似程度可以使用两个指标来量化：DNA甲基化和mRNA表达的干性指数（mDNAsi和mRNAsi），这两个指标被用作癌症干细胞评分。肿瘤干性指数取值范围从0到1，值接近1表明癌细胞具有较强的干性和较低的分化程度。肿瘤干细胞CSC 通过自我保护机制（如DNA 损伤修复、抑制凋亡途径和产生耐药蛋白）促进肿瘤进展、转移、耐药和自我更新增强。
该研究使用TCGA-STAD数据集探索了RECK与mRNAsi 的潜在关系，以进一步了解 RECK 功能。相关性分析显示 RECK 与 CSC 指数显著负相关（图3A）。通过层次聚类分析和主成分分析（PCA），根据CSC评分将样本分为三组（图3B），结果显示随着干细胞评分下降，RECK表达水平增加（图3C）。这些发现表明，RECK 高表达的患者可能与低 CSC 评分相关，这意味着这些患者可能表现出更好的治疗结果和预后。
随后，作者将TCGA-STAD 数据集根据RECK 表达水平中位数分为高、低两组。差异分析确定了组间总共2187个DEGs，并对DEGs进行富集分析。GO、KEGG和GSEA分析结果表明RECK可能参与了癌症进展的几个关键通路，包括MAPK信号（激活）、Wnt信号、细胞凋亡、DNA复制和细胞周期等（图3D-F）。这些通路在癌症的发生过程中非常常见。以上结果表明 RECK 的表达与富集到的癌症相关通路之间存在很强的关联，这可能有助于RECK 的抑癌作用。
（三）RECK高表达与高免疫状态、低肿瘤转移率显著正相关
由于CSC与肿瘤免疫状态和肿瘤转移密切相关，基于上述发现了RECK 与 CSC 指数显著负相关。，接下来，作者进一步研究了RECK表达与肿瘤免疫状态、转移之间的潜在联系。为了探索 RECK 表达与肿瘤微环境TME之间的相关性，使用“ESTIMATE”R 包来计算基质评分（肿瘤组织中基质细胞数量）、免疫评分（肿瘤组织中免疫细胞浸润）、Estimate评分（综合评分）和肿瘤纯度（肿瘤样本内肿瘤细胞的比例）。
相关性分析显示RECK表达水平与基质评分、免疫评分、estimate评分呈正相关，与肿瘤纯度呈负相关（图4A）。使用热图展现了CSC指数、RECK 表达水平以及分型和TME评分之间的关联（图4B）。随后研究了RECK表达与免疫浸润水平之间的关系。通过使用7种不同算法分别计算免疫细胞浸润水平与RECK表达量的相关性，结果发现，CD8+T细胞、CD4+T细胞、单核细胞、巨噬细胞的浸润水平与RECK表达量呈正相关（表1）。
通过对TCGA-STAD数据进行ssGSEA分析，结果表明高RECK表达对应的免疫细胞浸润水平高，证实了上述结果（图4C）。CD8+ T细胞在消灭恶性细胞中发挥重要作用，CD4+ T细胞在肿瘤转移过程中主要起免疫记忆和免疫保护作用。观察到的 RECK 表达与 CD8+/CD4+ T 细胞之间的正相关意味着，表达高水平 RECK 的 GC 患者可能在TME中有更多的 T 细胞，预后更好。使用TIP数据库进行癌症免疫周期活性评分，进一步证实了上述结果。在RECK 高表达组中， T 细胞募集、CD4+ T 细胞募集上调，免疫细胞向肿瘤的浸润上调（图4D）。
该结果说明RECK 表达升高意味着免疫反应增强，这可能使个体更容易接受抗肿瘤治疗干预。由于RECK和T细胞之间可能存在潜在关联，因此，作者计算了T细胞炎症评分。结果显示，T细胞炎症评分与RECK表达水平表现出正相关性（图4E）。随后使用 TCGA-STAD数据集的肿瘤样本分析RECK表达水平与抑制性免疫检查点的相关性。差异分析热图显示，RECK高表达组中 PD-1 (PDCD1) 和 PD-L1 (CD274) 下调，而 TIGIT 和 BTLA 上调（图4F）。该结果说明对于 RECK 表达升高的 GC 患者，针对 TIGIT 和 BTLA 免疫检查点的免疫治疗优于针对 PD-1 和 PD-L1 的免疫治疗。上述结果表明，高水平RECK 与TME中的高免疫状态（尤其是 CD4+ T 细胞）显著相关。RECK的表达水平有望作为指导GC患者免疫治疗策略的指标。
使用来自EMTome平台（EMT标志物泛癌分析数据库）的基因集，对TCGA STAD数据集进行GSVA评分。RECK表达与基因集评分之间的相关性分析表明RECK与GC患者的EMT显著相关（图4A）。对多个数据集（TCGA STAD、GSE13861、TCGA COAD、TCGA ESCA 和 TCGA READ 数据集）使用ssGSEA计算肿瘤免疫细胞的浸润水平。根据免疫浸润水平，将患者分为几种免疫亚型，对这些免疫亚型的差异分析显示，免疫状态越高，转移率越低，GSE13861和TCGA READ除外（Figure5.C右下角图有P值，但差异趋势相反，所以无意义）（图5B-F）。
综上所述，RECK 高表达可能与 GC 患者的高免疫状态微环境和低肿瘤转移率有关，并且可能是高免疫状态微环境和较低转移率之间的桥梁。
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（四）RECK通过阻滞G1-S 细胞周期、诱导细胞凋亡，发挥抑癌作用
使用GC细胞系进行RECK过表达和敲低，RT-qPCR、Western blot实验说明RECK高表达使GC细胞 G1-S 细胞增殖周期阻滞并发生细胞凋亡。
（五）RECK通过抑制GC细胞的EMT过程，抑制肿瘤转移
对RECK过表达和敲低GC细胞系进行伤口愈合迁移和跨孔侵袭测定实验，结果表明RECK的过表达显著抑制GC细胞的迁移和侵袭。Western实验检测EMT标志物的蛋白水平结果表明RECK 阻碍 EMT 相关基因的表达，从而抑制 GC 细胞的迁移和侵袭。
（六）高水平RECK降低GC细胞中的ERK磷酸化
通过蛋白质印迹法在 RECK 上调或下调的 AGS 和 HGC-27 细胞中检查了 KEGG、GSEA产生的 MAPK 信号传导（图3E-F）。研究结果证实，RECK表达抑制 MAPK 信号传导中 ERK 的磷酸化，而不影响JNK 或 p38。
（七）ERK磷酸化介导RECK抑制GC细胞增殖和EMT过程
使用ERK抑制剂和激活剂处理RECK 上调或下调的GC细胞，进行集落形成、EdU 和流式细胞术测定细胞周期实验，结果表明ERK 磷酸化激活抑制了 RECK 对GC细胞增殖和EMT过程的抑制，RECK在胃癌中的抗增殖和抗转移作用是ERK依赖性的。
（八）RECK通过阻碍ERK1/2磷酸化促进CALD1表达，抑制CALD1磷酸化失活
采用相关分析来筛选与RECK相关的基因，以相关系数≥0.8且p<0.05为标准筛选出172个基因。通过 STRING 平台构建了 172 个基因的蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络，并通过 Cytoscape 软件进行可视化（图 6A）。图6B展现出连接程度最高的前30个基因。与RECK直接相关的三个基因包括CALD1、TIMP2和GPR124（图6C）。考虑连接程度、相关系数和之前的研究，谨慎选择CALD1进行进一步的研究。随后，通过 qRT-PCR、蛋白质印迹分析和 HPA 数据库（Human Protein Atlas）验证了GC细胞系中 CALD1 的显著下调（图6D-F）。ERK激活剂处理导致 GC细胞中 CALD1 表达明显降低，而 CALD1 磷酸化增加，结果表明 ERK 磷酸化水平显著调节 CALD1 磷酸化水平。RECK 过表达促进了 GC细胞中 CALD1 的表达水平，并使 CALD1 磷酸化失活水平下降。这些结果表明RECK可能通过抑制ERK1/2磷酸化来促进CALD1表达水平和CALD1磷酸化失活下降。
（九）CALD1 介导 RECK 诱导的 GC 细胞增殖抑制和 EMT 过程
为了更深入地了解GC中CALD1表达对RECK抗癌特性的影响，通过重组质粒和RNA干扰进行了RECK和CALD1转染的共转染实验。集落形成和流式细胞术测定细胞周期等实验表明，CALD1 的下调导致GC细胞的 RECK 过表达诱导的细胞增殖抑制显著消除，细胞凋亡比例下降，对GC细胞迁移、侵袭和 EMT 过程抑制作用减弱。CALD1 过表达明显抵消了 RECK 敲低对细胞增殖和 EMT 过程的促肿瘤影响。上述结果表明 RECK 在胃癌中的抗增殖和抗转移作用是CALD1依赖性的。
小结
本篇文章的故事线：
之前研究发现RECK发挥重要的抑癌作用，而RECK在胃癌中的研究很少且不清楚背后的调控机制，因此本篇文章探索RECK在胃癌中的作用。
作者首先不仅使用TCGA-STAD数据集进行数据挖掘，同时还结合GEO公共数据和蛋白数据等进行验证。通过结合基因表达数据和多组临床性状数据以及生存数据分析，发现RECK 在胃腺癌（STAD）患者中低表达，RECK表达上调能抑制肿瘤进展，并且是胃癌良好预后指标。
此外，富集分析（GO、KEGG、GSEA）发现MAPK信号、细胞凋亡等激活，DNA复制和细胞周期等通路抑制。进一步通过相关性分析得出RECK表达与肿瘤干性指数负相关的结论，而肿瘤干性指数与肿瘤免疫状态和肿瘤转移密切相关，因此进一步挖掘RECK表达数据与肿瘤免疫状态和肿瘤转移之间的联系。最后，作者通过肿瘤微环境、免疫浸润水平分析和EMT基因集相关性分析，发现RECK高表达与高免疫状态（CD4 T细胞等免疫细胞浸润）正相关，与胃癌的EMT过程负相关。
随后说一下实验部分：作者首先对GC细胞系敲低、过表达RECK，通过RT-qPCR、Western实验、细胞划痕实验等验证RECK高表达抑制GC细胞增殖、促进凋亡，抑制肿瘤转移等结论。之前的KEGG、GSEA分析富集到了MAPK通路，因此深挖影响MAPK通路的分子机制，wetern等实验发现RECK高表达抑制ERK磷酸化。此外，根据基因表达相关性分析、蛋白互作网络PPI筛选出几个RECK相关基因，结合之前的研究，选择CALD1进一步探索分子机制，发现ERK磷酸化导致CALD1发生磷酸化失活，表达水平下降，而RECK发挥的抑癌作用是CALD1依赖性的。综上，大致得到以下结论：RECK抑制MAPK通路的ERK磷酸化，避免CALD1被磷酸化的ERK磷酸化失活，从而依赖有活性的CALD1发挥抑制胃癌细胞增殖、促进凋亡，抑制肿瘤转移的作用。
研究观点：
此项研究是一篇经典的干湿结合文章，前半部分围绕单基因（RECK）在特定疾病（胃癌）中的作用进行生信数据挖掘，主要使用了TCGA胃癌数据集和GEO数据。后半部分为实验部分，根据数据挖掘的发现展开实验，一方面验证了公共数据分析得到的结论，另一方面根据富集分析得到的通路和PPI筛选的相关基因继续深挖分子机制，寻找下游靶点，最后形成了一个比较完整的故事。
