目前单细胞测序获取细胞的方法主要有两种：
（1）Smart-seq：测序细胞量少(因为一次通过一个细胞)，但是测序的reads数多；
（2）Drop-seq(10X )：可以测许多细胞，但是测得深度不深。
前些天练习了smartseq2的单细胞测序流程。这次就来练习一下10×测序的分析。

这次要练习的文章：
Acquired cancer resistance to combination immunotherapy from transcriptional loss of class I HLA（2018年9月发表在NC）。文章的具体解析在这里：爱恨难分—癌症免疫治疗获得性抗性。

这篇文章的测序样品来自两名患者（单细胞实战(一)数据下载）：
患者2586-4：利用10X 3' Chromium v2.0平台建库 + Hiseq2500 "rapid run"模式。
（1）discovery tumor部分：After sequence alignment and filtering, 7431 tumor cells (2243 cells before and 5188 cells after T cell therapy）
（2）discovery PBMC部分：After sequence alignment and filtering, a total of 12,874 cells were analyzed [其中包含了四个时间点：治疗前(Pre)，治疗后早期day +27(Early)，治疗后反应期day+37(Resp)，治疗后复发+614 (AR)]

患者9245-3：利用10X 5' V(D)J 进行cell washing, barcoding and library prep+ NovaSeq 6000(gene expression) + Hiseq4000 (V(D)J)。
The second validation patient (9245-3) is a 59-year-old man with metastatic MCC that had initially presented as stage IIIB disease, now metastatic at multiple sites.

（一）数据下载，提取fastq文件
首先下载原始数据。刚开始我在EBI上直接下载的fastq文件，可是看到教程里说后续的cell ranger软件分析需要输入两个文件。所以我又改下了sra文件（下载的方法就不说了，我的前一篇单细胞测序实战的文章里有提到如何批量下载），用fastq-dump提取fastq文件，这样就可以在使用fastq-dump时加参数，把read和UMI+Barcode文件分开来了。

#!/bin/bash
for i in SRR77229*
do
        echo $i
        fastq-dump --gzip --split-files /media/yanfang/FYWD/RNA_seq/sra_files/patient2586/$i
done

然后简单的看一下_1,_2,_3文件里都是写什么：

$ zless -SN SRR7722937_1.fastq.gz | head
@SRR7722937.1 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1119:1866 length=8
TTTCATGA
+SRR7722937.1 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1119:1866 length=8
GGGGGIII
@SRR7722937.2 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1182:1935 length=8
TTTCATGA
+SRR7722937.2 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1182:1935 length=8
AAAAGGGG
@SRR7722937.3 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1398:1864 length=8
TTTCATGA

$ zless -SN SRR7722937_2.fastq.gz | head
@SRR7722937.1 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1119:1866 length=26
AGCAGCCGTGACTACTGTATTGCGAC
+SRR7722937.1 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1119:1866 length=26
AGGGGIIIIIGGIIIIIIIIIIIIGG
@SRR7722937.2 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1182:1935 length=26
GCTCCTAAGACACTAAGGCCTGTACC
+SRR7722937.2 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1182:1935 length=26
A<AAGGGA<<AAGGAGIAAGGAGG<G
@SRR7722937.3 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1398:1864 length=26
GCTGCTTTCTTCCTTCTAGGTACGTT

$ zless -SN SRR7722937_3.fastq.gz | head
@SRR7722937.1 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1119:1866 length=98
NNNNNCTGTAATCCCAGCCAGGAGGACTGCTTGAACCCGGGAGGCAGAGGTTTCAGTGAGCTGAGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGACAGAGTGA
+SRR7722937.1 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1119:1866 length=98
#####<.<G<GGAAGGA.AGGGGGGIIIGAAGGGAAGG<AAAAAGGGAAA<GGGGGGGAAGGGAGGGA<GGGGIGGGAAAGGGGGGGGGGAGG..AAA
@SRR7722937.2 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1182:1935 length=98
GCGAAAAGTCCTAATAGTAGAAGAACCCTCCATAAACCTGGAGTGACTATATGGATGCCCGCCACCCTACCACACATTCGAAGAGCCCGTATACATAA
+SRR7722937.2 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1182:1935 length=98
.GGAGGGG.<.GGG.<AAGGGGGG.G.GGGAG.A.G.AAGGGAAGG.<AG<<GAGGGGAG.<<A...AGAGGGAAA.GGG..<...<.<.<.<G..<G
@SRR7722937.3 SN367:911:HKMNCBCXY:1:1103:1398:1864 length=98
NNNNNATCTAATTAAACGTAAGCACTTCTGCACAGGGAAAGAAACTATCATCAGAGTGAACAAGCAACCTATAGAATGGGAGAATATTTTTGCCATCA

_1文件里每条序列8bp，_2文件里每条序列26bp，_3文件里每条序列98bp，这篇文献用的测序平台是10X Genomics 3' Chromium v2.0。那就要先知道这个平台的文库组成是什么样的。根据教程单细胞实战(二) cell ranger使用前注意事项：

这里面的read2长度不固定，有时会短几bp。Barcode用来标记细胞和细胞计数。UMI就是Unique Molecular Identifier，由4-10个随机核苷酸组成（所以上面的fastq文件里_1就是UMI），在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA随机连上一个UMI（标记转录本），结果可以计数不同的UMI，最终统计mRNA的数量，这样与参考基因组比对后就可以定量基因的表达量 (转录本数量,近乎绝对定量)。那测序时需不需要加入标准物（如ERCC）的时候，官方给出的建议是不建议加ERCC（考虑到成本和影响细胞和基因的计数）。

根据教程里说的，我们需要把几个文件名改一下，方便后续的分析。

# 将原来的_1.fastq.gz改成_S1_L001_I1_001.fastq.gz
# 依次类推，将原来_2的改成R1，将_3改成R2。批量处理，就利用下载SRA的SRR ID好了。
cat SRR_Acc_List.txt | while read i ;do (mv ${i}_1*.gz ${i}_S1_L001_I1_001.fastq.gz;mv ${i}_2*.gz ${i}_S1_L001_R1_001.fastq.gz;mv ${i}_3*.gz ${i}_S1_L001_R2_001.fastq.gz);done

（ID如何下，请参考教程单细胞实战(一)数据下载 ）

（二）了解Cell Ranger的使用
首先，Cell Ranger是什么？ 官网的回答：Cell Ranger is a set of analysis pipelines that process Chromium single cell 3’ RNA-seq output to align reads, generate gene-cell matrices and perform clustering and gene expression analysis.也可以看这篇文章的介绍（10X单细胞测序分析软件:Cell ranger，从拆库到定量）：

cellranger是10X genomics公司为单细胞RNA测序分析量身打造的数据分析软件，可以直接输入Illumina 原始数据（raw base call ，BCL或FASTQ)直接进行文库拆分、细胞拆分、输出表达定量矩阵、降维（PCA），聚类（Graph-based& K-Means）以及可视化（t-SNE）结果，结合配套的Loupe Cell Browser给予研究者更多探索单细胞数据的机会。

其次，这个软件能干点啥？ 教程的答案（单细胞实战(三) Cell Ranger使用初探）：
它主要包括四个主要基因表达分析流程：
（1）cellranger mkfastq ： 它借鉴了Illumina的bcl2fastq ，可以将一个或多个lane中的混样测序样本按照index标签生成样本对应的fastq文件
（2）cellranger count ：利用mkfastq生成的fq文件，进行比对(基于STAR)、过滤、UMI计数。利用细胞的barcode生成gene-barcode矩阵，然后进行样本分群、基因表达分析
（3）cellranger aggr ：接受cellranger count的输出数据，将同一组的不同测序样本的表达矩阵整合在一起，比如tumor组原来有4个样本，PBMC组有两个样本，现在可以使用aggr生成最后的tumor和PBMC两个矩阵，并且进行标准化去掉测序深度的影响
（4）cellranger reanalyze ：接受cellranger count或cellranger aggr生成的gene-barcode矩阵，使用不同的参数进行降维、聚类
它的结果主要是包含有细胞信息的BAM, MEX, CSV, HDF5 and HTML文件。

（三）下载安装cellranger，并下载10×Genomics所用的参考基因组信息
课程里写的是为了重复文章，所以他下载了和作者一样的cellranger2.0版本和2.1版本。然而，我根据课程的链接，并不能下载到这两个版本。。。所以我索性就下载了最新版3.1。主要目的是走一个流程，版本对我来讲无所谓。
（1）下载cellranger3.1版
去官网下载：https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest

$ curl -o cellranger-3.1.0.tar.gz "http://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-3.1.0.tar.gz?Expires=1572780358&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cDovL2NmLjEweGdlbm9taWNzLmNvbS9yZWxlYXNlcy9jZWxsLWV4cC9jZWxscmFuZ2VyLTMuMS4wLnRhci5neiIsIkNvbmRpdGlvbiI6eyJEYXRlTGVzc1RoYW4iOnsiQVdTOkVwb2NoVGltZSI6MTU3Mjc4MDM1OH19fV19&Signature=DtuIA6Dyzv22DB7LfJAqlWhytmcAEHgEVzSR9YgQnkbW91MkFvorTSoOW2wFjRtF9NytOUdeA4M~oFci9su1Yh-3ZTKR27~qaZ-neywY96OppGtqcsgyr6iiWi91bICHOvkD5pVUrVsf0-u5rz9kd0NxltWCoEeVz8EECsocEnlYDL5SG1F1ykFn~WxQPvgX67puz816A0cN69jRDHMdzR4d3mVxj72SmXT193Y5r0UF0Kamyqovb1JRLAl~bz6Km8fomjBOSXlwGQIFllzAyjRHbQPCmisE3YnoetCW1sRl1-yDtYoRp1N16fP~qP8t8pWP-XEtBlhMFNR-~ZGSeg__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"

（2）基因组下载
对于cellranger所用的基因组，官方是这样给的说明：Cell Ranger references are typically backwards compatible. It is not necessary to use a reference version that matches your Cell Ranger version.也就是说，这个3.1版本的cellranger可以兼容之前所有版本使用的基因组版本，不需要非要和3.1版本对应。所以我下载了一下3.0版本的基因组信息。（强迫症的童鞋可以去下载同样版本的基因组哈！）
人类GRCh38：

$ wget http://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0.tar.gz
或者
$ curl -O http://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0.tar.gz   #这个貌似快一些
#解压
$ tar -xzvf refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0.tar.gz 

人类hg19：

$ wget http://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-cellranger-hg19-3.0.0.tar.gz
或者
$ curl -O http://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-cellranger-hg19-3.0.0.tar.gz
#解压
$ tar -xzvf refdata-cellranger-hg19-3.0.0.tar.gz 

小鼠：

$ wget http://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-cellranger-mm10-3.0.0.tar.gz
或者
$ curl -O http://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-cellranger-mm10-3.0.0.tar.gz
#解压
$ tar -xzvf refdata-cellranger-mm10-3.0.0.tar.gz 

ERCC下载：

$ curl -O http://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-cellranger-ercc92-1.2.0.tar.gz

安装cellranger:

#先解压
$ tar zxvf cellranger-3.1.0.tar.gz
#添加环境变量
$ echo 'export PATH=/media/yanfang/FYWD/RNA_seq/cellranger/cellranger-3.1.0:$PATH' >> ~/.bashrc
#试一下看看是不是安装成功了
$ cellranger
/media/yanfang/FYWD/RNA_seq/cellranger/cellranger-3.1.0/cellranger-cs/3.1.0/bin
cellranger  (3.1.0)
Copyright (c) 2019 10x Genomics, Inc.  All rights reserved.
-------------------------------------------------------------------------------

Usage:
    cellranger mkfastq
    cellranger count
    cellranger aggr
    cellranger reanalyze
    cellranger mat2csv
    cellranger mkgtf
    cellranger mkref
    cellranger vdj
    cellranger mkvdjref
    cellranger testrun
    cellranger upload
    cellranger sitecheck

上面我们下载的基因组信息，解压以后可以看一下几个子文件里都有什么：

#举个栗子，GRCh38的文件夹
$ tree
.
├── fasta
│   ├── genome.fa
│   └── genome.fa.fai
├── genes
│   └── genes.gtf
├── pickle
│   └── genes.pickle
├── reference.json
└── star
    ├── chrLength.txt
    ├── chrNameLength.txt
    ├── chrName.txt
    ├── chrStart.txt
    ├── exonGeTrInfo.tab
    ├── exonInfo.tab
    ├── geneInfo.tab
    ├── Genome
    ├── genomeParameters.txt
    ├── SA
    ├── SAindex
    ├── sjdbInfo.txt
    ├── sjdbList.fromGTF.out.tab
    ├── sjdbList.out.tab
    └── transcriptInfo.tab
4 directories, 20 files

这里要注意的是，这里下载的GTF文件和我们通常下载的GTF是不一样的，这里的GTF文件是只包含有注释的基因类型。

（四）cellranger的使用
Cell Ranger主要的流程有：拆分数据 mkfastq、细胞定量 count、定量组合 aggr、调参reanalyze（单细胞实战(四) Cell Ranger流程概览 ）。
(1)mkfastq 拆分数据
由于这篇文献作者没有上传最原始的BCL文件，所以我们没有办法练习BCL文件转化成fastq文件。一般是利用mkfastq或者bcl2fastq将BCL转成fastq文件。在教程（CellRanger走起(四) Cell Ranger流程概览）里有一些介绍，可以看看。
（2）count 细胞定量
这个过程要做的是细胞和基因的定量，过程包括比对、质控、定量。
先来看看使用方法：

$ cellranger count
/media/yanfang/FYWD/RNA_seq/cellranger/cellranger-3.1.0/cellranger-cs/3.1.0/bin
cellranger count (3.1.0)
Copyright (c) 2019 10x Genomics, Inc.  All rights reserved.
-------------------------------------------------------------------------------
Usage:
    count
        --id=ID  #这个ID是指输出文件存放目录名
        [--fastqs=PATH]  #fastq文件储存的位置
        [--sample=PREFIX] #sample要和fastq文件的前缀中的sample保持一致，作为软件识别的标志
        --transcriptome=DIR #参考基因组存放位置
        [options]
    count <run_id> <mro> [options]
    count -h | --help | --version

利用了STAR比对的方法，可以看一下教程对于STAR比对的简单介绍（CellRanger走起(四) Cell Ranger流程概览）：

这款比对工具比对速度快，灵敏度高，是ENCODE、GATK推荐使用的工具，允许基因的可变剪切。比对完之后，利用GTF文件将reads溯源回外显子区、内含子区、基因间区：如果一条read的50%以上与外显子有交集，那么就认为它在外显区；如果不在外显子区，与内含子有交集，那么就认为它在内含子区；与外显子、内含子都没有交集，那么就认为在基因间区。

然后就开始按照格式把自己的文件储存位置加上，比如patient2586的第一个样品SRR7722937：

$ cellranger count --id=patient2586   \
--fastqs=/media/yanfang/FYWD/RNA_seq/fastq_files/patient2586  \
--transcriptome=/media/yanfang/FYWD/RNA_seq/ref_genome/10_genomic_scRNA_refgenome/GRCh38/refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0   \
--sample=SRR7722937 \
--nosecondary \
--jobmode=local
# nosecondary 只获得表达矩阵，不进行后续的降维、聚类和可视化分析(因为后期会自行用R包去做)
#jobmode:using 90% of available memory and all available cores

代码写好，可以运行了。但是cell ranger软件运行对电脑的配置是有要求的。。。

这是官网的说明。然而我的电脑内存只有8G，而且我没有服务器，距离最低要求64G差的太多了。我尝试着运行了一下：

2019-11-03 22:30:23 [runtime] (ready)           ID.patient2586.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.DISABLE_FEATURE_STAGES
2019-11-03 22:30:23 [runtime] (run:local)       ID.patient2586.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.DISABLE_FEATURE_STAGES.fork0.chnk0.main
2019-11-03 22:30:23 [runtime] (ready)           ID.patient2586.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.CHEMISTRY_DETECTOR.DETECT_CHEMISTRY
2019-11-03 22:30:23 [runtime] (run:local)       ID.patient2586.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.CHEMISTRY_DETECTOR.DETECT_CHEMISTRY.fork0.chnk0.main
2019-11-03 22:30:23 [runtime] (ready)           ID.patient2586.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.SC_RNA_ANALYZER.CHOOSE_DIMENSION_REDUCTION
2019-11-03 22:30:23 [runtime] (run:local)       ID.patient2586.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.SC_RNA_ANALYZER.CHOOSE_DIMENSION_REDUCTION.fork0.chnk0.main
2019-11-03 22:30:24 [runtime] (chunks_complete) ID.patient2586.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.DISABLE_FEATURE_STAGES

然而只能跑一小会儿，然后就一直不动了，我只尝试了一个样，过夜跑还是停留在这个状态。。。我问了王院长，他说现在的10×单细胞测序一般公司可以把最后的count矩阵给你，不需要自己跑了。（我也不知道是真的假的，也有可能是他老板比较有钱？）总之要确保自己的电脑达到了cell ranger的最低配置要求。

虽然不能跑，但是还是来简单的了解一下输出的文件都有哪些（10X单细胞测序分析软件:Cell ranger，从拆库到定量）：
输出文件:
.outs
├── analysis【数据分析文件夹】
│ ├── clustering【聚类，图聚类和k-means聚类】
│ ├── diffexp【差异分析】
│ ├── pca【主成分分析线性降维】
│ └── tsne【非线性降维信息】
├── cloupe.cloupe【Loupe Cell Browser 输入文件】
├── filtered_feature_bc_matrix【很重要，Seurat, Monocle的输入文件】
│ ├── barcodes.tsv.gz
│ ├── features.tsv.gz
│ └── matrix.mtx.gz
├── filtered_feature_bc_matrix.h5【过滤掉的barcode信息HDF5 format】
├── metrics_summary.csv【CSV format数据摘要】
├── molecule_info.h5【aggregate的时候会用到的文件】
├── raw_feature_bc_matrix【原始barcode信息】
│ ├── barcodes.tsv.gz
│ ├── features.tsv.gz
│ └── matrix.mtx.gz
├── possorted_genome_bam.bam【比对文件】
├── possorted_genome_bam.bam.bai【索引文件】
├── raw_feature_bc_matrix.h5【原始barcode信息HDF5 format】
├── web_summary.html【网页简版报告以及可视化】
└── *_gene_bar.csv_temp【过程文件】

（3） 构建Aggregation CSV
（4） 运行aggr
当实验中用到了多个GEM well，并且想放在一起分析时，需要先用cellranger count分析各个来自于一个GEM well的fastq文件 (与是否同一个lane测序没关系)，然后再用cellranger aggr进行整合。

什么是 GEM Wells?
看这篇文章是怎么解释的：（10X单细胞测序分析软件:Cell ranger，从拆库到定量）每个GEM well是10X芯片上的一个单独的区室，从barcode池 (barcode whitelist，前面--qc的结果中有，评估barcode测序准确度，进而影响细胞鉴定准确度)中随机获取barcode用于标记细胞。为了保证整合多个文库时barcode不发生冲突，通常会在barcode后面加一个数字，标记其来源的GEM well，如AGACCATTGAGACTTA-1和AGACCATTGAGACTTA-2，barcode序列一样，但来源于不同的GEM well，也是不同的细胞。

这两步我没办法运行，但是这里的课程（CellRanger走起(四) Cell Ranger流程概览）里对于这两步有具体的代码，可以参考。也可以直接去官网（https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate）里也有非常详细的步骤和代码。对于有条件的童鞋，在运行完上面的步骤后，可以参考教程（10X scRNA免疫治疗学习笔记-2-配置Seurat的R语言环境）来进行后续的分析。下面我会直接使用作者上传的原始矩阵进行后续的练习。

（五）下载文章的原始矩阵，并利用Seurat进行后续分析
下载地址在这里：patient2586

先练习PBMC这个矩阵，练习的流程按照教程走（10X scRNA免疫治疗学习笔记-3-走Seurat标准流程）。
(1)载入数据

> rm(list = ls()) 
> options(warn=-1) 
> suppressMessages(library(Seurat))
#在载入R包时候常常会出现一些消息，如版本或函数覆盖的消息。这些消息是不必要的，可以使用suppressMessages()来进行关闭。
#设置工作文件夹
> setwd("/media/yanfang/FYWD/RNA_seq/matrix/10×scRNA_analysis")
# 读取表达矩阵
> start_time <- Sys.time() #获取当前的系统时间，达到秒的精度
> raw_dataPBMC <- read.csv('./GSE117988_raw.expMatrix_PBMC.csv.gz', header = TRUE, row.names = 1)
> dim(raw_dataPBMC) #17712基因，12874细胞

(2)对文库大小进行归一化

> #sweep()里第一个要标注对哪个矩阵进行操作；第二个位置1和2跟apply一样的，2表示列；
> #第三个位置是要操作的向量，如果要对行操作，那么这个向量长度就要和行数一样
> #最后一个位置是计算符，比如：+ - * / < > 等
> dataPBMC <- log2(1 + sweep(raw_dataPBMC, 2, median(colSums(raw_dataPBMC))/colSums(raw_dataPBMC), '*'))

所以这里的操作是：先求每个细胞文库的总大小，然后用它的中位数除以总大小得到一个小数，然后按列乘以这个小数就相当于对文库进行了归一化，将文库本身的大小差异置之度外（10X scRNA免疫治疗学习笔记-3-走Seurat标准流程）。
NOTE:对于sweep()，还可以看看这篇文章：R中的sweep函数。

（3）划分时间点
在这篇文献里，作者使用了4个时间点。

> head(colnames(dataPBMC))
[1] "AAACCTGAGCGAAGGG.1" "AAACCTGAGGTCATCT.1" "AAACCTGAGTCCTCCT.1" "AAACCTGCACCAGCAC.1" "AAACCTGGTAACGTTC.1"
[6] "AAACCTGGTAAGGATT.1"
> tail(colnames(dataPBMC))
[1] "TTTGTCAAGCGAGAAA.4" "TTTGTCAAGGAATTAC.4" "TTTGTCAAGTGCGTGA.4" "TTTGTCACACGAGGTA.4" "TTTGTCATCATTGCGA.4"
[6] "TTTGTCATCCACGCAG.4"

这里的.1到.4分别对应着：
1 => PBMC_Pre
2 => PBMC_EarlyD27
3 => PBMC_RespD376
4 => PBMC_ARD614
然后把上面列名里.1.2.3.4分别提取出来，分成4个组：

> timePoints <- sapply(colnames(dataPBMC), function(x) unlist(strsplit(x, "\\."))[2]) #点号是正则匹配符，需要用\\来转义
> table(timePoints)
timePoints
   1    2    3    4 
2082 1592 4684 4516

把1,2,3,4对应到具体的时间点名称上：

#对应到具体的时间点名称上
> timePoints <-ifelse(timePoints == '1', 'PBMC_Pre', 
                     ifelse(timePoints == '2', 'PBMC_EarlyD27',
                            ifelse(timePoints == '3', 'PBMC_RespD376', 'PBMC_ARD614')))
> table(timePoints)
timePoints
  PBMC_ARD614 PBMC_EarlyD27      PBMC_Pre PBMC_RespD376 
         4516          1592          2082          4684

（4）对表达矩阵进行质控
第一步：过滤一个基因在多少细胞表达

# fivenum():返回五个数据：最小值、下四分位数、中位数、上四分位数、最大值。
#对于奇数个数字，fivenum()先排序，依次返回最小值、下四分位数、中位数、上四分位数、最大值
> fivenum(apply(dataPBMC,1,function(x) sum(x>0) ))
RP4-669L17.10         LAMB3         NAT10    AC093673.5         RPL21 
            1             6            50           207         12102
#结果显示有75%的基因在207个细胞里表达

第二步：每一个细胞里有多少个基因表达

> fivenum(apply(dataPBMC,2,function(x) sum(x>0) ))
CAAGAAATCGATCCCT.2 GGCCGATTCCAGAGGA.3 TCAACGAAGAGCTGGT.3 TGCCAAAGTCTGCGGT.4 TCTGGAATCTATCGCC.3 
                10                321                395                481               2865
#结果说明75%的细胞里只表达481个基因

一般来说：10X的数据应该能做到平均表达800个基因

#hist 用于绘制直方图，横坐标为不同的区间，纵坐标为落入该区间内的频数
> hist(apply(dataPBMC,2,function(x) sum(x>0) ))

开始Seurat分析流程
（5）创建Seurat对象

> PBMC <- CreateSeuratObject(dataPBMC, 
                            min.cells = 1, min.features = 0, project = '10x_PBMC')
> PBMC
An object of class Seurat 
17712 features across 12874 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (17712 features)

（6）添加metadata

> PBMC <- AddMetaData(object = PBMC, 
                     metadata = apply(raw_dataPBMC, 2, sum),
                     col.name = 'nUMI_raw')
> PBMC <- AddMetaData(object = PBMC, metadata = timePoints, col.name = 'TimePoints')

（7）聚类
标准流程：
标准化、找高变异基因、根据这些基因进行PCA降维、根据PCA结果找分群、TSNE降维、可视化。
NOTE：这里我安装的seurat是V3版本的，如果是V2版本的话，代码会有些许不同。在教程里有两个版本的代码，可以参考（10X scRNA免疫治疗学习笔记-3-走Seurat标准流程）。

#标准化
> PBMC <- ScaleData(object = PBMC, vars.to.regress = c('nUMI_raw'), model.use = 'linear', use.umi = FALSE)
#然后会弹出下面的进度条
Regressing out nUMI_raw
  |=============================================================================================================| 100%
Centering and scaling data matrix
  |=============================================================================================================| 100%

#找高变基因，这里Seurat V3里是FindVariableFeatures()， 而V2是FindVariableGenes()
> PBMC <- FindVariableFeatures(object = PBMC, mean.function = ExpMean, dispersion.function = LogVMR, mean.cutoff = c(0.0125,3), dispersion.cutoff = c(0.5,Inf))

Calculating gene variances
0%   10   20   30   40   50   60   70   80   90   100%
[----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
**************************************************|
Calculating feature variances of standardized and clipped values
0%   10   20   30   40   50   60   70   80   90   100%
[----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
**************************************************|

# PCA降维
> PBMC <- RunPCA(object = PBMC, pc.genes = PBMC@var.genes)

PC_ 1 
Positive:  FTL, FTH1, S100A9, GPX1, CST3, LYZ, S100A8, SAT1, AIF1, PPBP 
       LST1, FCN1, CTSS, CSTA, PF4, S100A12, GNG11, TYROBP, PSAP, NRGN 
       SDPR, VCAN, COTL1, LGALS2, S100A6, RP11-1143G9.4, MAP3K7CL, NEAT1, HIST1H2AC, RGS18 
Negative:  NKG7, IL32, GNLY, GZMA, HLA-A, UBB, CST7, MALAT1, GZMH, GZMB 
       CTSW, FGFBP2, KLRB1, CD7, BTG1, HOPX, CMC1, CD247, LTB, KLRD1 
       PRF1, CD3D, CXCR4, GZMM, TRBC2, TRBC1, TRAC, TRDC, CCL5, HBA1 
PC_ 2 
Positive:  S100A9, LYZ, S100A8, AIF1, FCN1, CTSS, LST1, S100A6, TYROBP, FTL 
       CSTA, NEAT1, S100A11, S100A12, VCAN, LGALS2, RP11-1143G9.4, CST3, TYMP, PSAP 
       LGALS1, SERPINA1, DUSP1, S100A4, FOS, MNDA, VIM, MAFB, CD14, MS4A6A 
Negative:  PF4, GNG11, SDPR, HIST1H2AC, TUBB1, PPBP, ACRBP, RGS18, CLU, NRGN 
       GP9, SPARC, MAP3K7CL, NGFRAP1, NCOA4, TSC22D1, TREML1, MMD, PTCRA, RUFY1 
       PGRMC1, CLEC1B, C6orf25, HIST1H3H, CMTM5, ITGA2B, TMEM40, MYL9, TUBA4A, CCL5 
PC_ 3 
Positive:  HBB, HBA1, HBA2, ALAS2, CD79A, AHSP, HBD, SNCA, IGKC, IGHD 
       SLC25A37, IGHM, HLA-DRA, TCL1A, CA1, CD79B, HBM, CD74, MS4A1, IGLC2 
       HLA-DQA1, SLC25A39, VPREB3, LTB, BLVRB, HLA-DRB1, BANK1, BPGM, LINC00926, FCER2 
Negative:  NKG7, B2M, CCL5, CST7, GNLY, GZMB, HLA-A, GZMA, FGFBP2, S100A4 
       MALAT1, HCST, GZMH, CTSW, ACTB, IFITM2, PRF1, KLRB1, KLRD1, ACTG1 
       CD247, GAPDH, CMC1, CD7, HOPX, KLRF1, SPON2, SRGN, TRDC, FCGR3A 
PC_ 4 
Positive:  HBA1, HBA2, HBB, ALAS2, AHSP, HBD, SNCA, SLC25A37, CA1, HBM 
       BLVRB, UBB, SLC25A39, BPGM, MPP1, GMPR, HBQ1, S100A8, PDZK1IP1, S100A9 
       S100A12, NCOA4, LYZ, VCAN, IFI27, RP11-1143G9.4, TYROBP, MYL4, FOS, CSTA 
Negative:  CD74, CD79A, MALAT1, HLA-DRA, HLA-DPB1, CD37, IGHD, HLA-DRB1, BTG1, IGKC 
       CD79B, HLA-DPA1, HLA-DQA1, IGHM, TCL1A, CXCR4, B2M, CD52, MS4A1, IGLC2 
       LTB, HLA-DQB1, VPREB3, BANK1, PLPP5, FCER2, LINC00926, IGLC3, CD69, HLA-DOB 
PC_ 5 
Positive:  TRAC, IL7R, CD3D, IL32, LTB, GZMK, CD52, TRBC2, VIM, CD8A 
       DUSP2, TRBC1, JUNB, MALAT1, B2M, S100A4, GAPDH, KLRG1, S100A12, TRGC2 
       HLA-A, S100A6, S100A8, VCAN, CXCR4, RP11-1143G9.4, BTG1, FOS, S100A9, MIAT 
Negative:  FCGR3A, HLA-DRA, GZMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, CD74, UBB, FGFBP2, HLA-DRB1, SPON2 
       TYROBP, FCER1G, PRF1, KLRF1, HLA-DQA1, NKG7, CD79A, CD79B, RHOC, HBA1 
       CST7, HBA2, ALAS2, HBB, HBD, IGHD, AHSP, IFITM3, CLIC3, IGFBP7

#根据PCA结果找分群，要分两步，而Seurat V2版本在这里只有一步
> PBMC <- FindNeighbors(PBMC, reduction = "pca", dims = 1:10,
                       k.param = 35)
Computing nearest neighbor graph
Computing SNN

> PBMC <- FindClusters(object = PBMC, 
                      resolution = 1, verbose=F)
#需要注意的是，这里的resolution的赋值会影响后面的分群个数

#tSNE降维
> PBMC <- RunTSNE(object = PBMC, dims.use = 1:10)

这里提一句：

t-SNE中集群之间的距离并不表示相似度 ，同一个数据上运行t-SNE算法多次，很有可能得到多个不同“形态”的集群。

#可视化
> DimPlot(PBMC, cols = c('green4', 'pink', '#FF7F00', 'orchid', '#99c9fb', 'dodgerblue2', 'grey30', 'yellow', 'grey60', 'grey', 'red', '#FB9A99', 'black'))

Error: Insufficient values in manual scale. 14 needed but only 13 provided.

这一步我按照教程里的代码，输入了13个不同的颜色，结果报错，说需要14个颜色，少了一个。（之所以会少一个群是因为前面的resolution我用的是1，如果用0.9就会得到13个群）于是我就看了帮助文档，想查一下颜色的代号，帮助文档里说这个网站（http://colorbrewer2.org/#type=sequential&scheme=RdPu&n=3）可以挑选不同的颜色，并且有其代号。所以我挑了一个颜色以后，把代号加入到上面的代码里：

> DimPlot(PBMC, cols = c('green4', 'pink', '#FF7F00', 'orchid', '#99c9fb', 'dodgerblue2', 'grey30', 'yellow', 'grey60', 'grey', 'red', '#FB9A99', 'black', '#c51b8a'))

（8）看看作者整合的批次之间的差距
这一步就不像上面按照细胞群来做tSNE了，这回按照作者分的4个时间点来映射。理论上在所有时间点里应该有所有细胞类型。

> TSNEPlot(PBMC,group.by = "TimePoints")

四个时间点有所有细胞类型

> #用table对比一下
> table(PBMC@meta.data$TimePoints,PBMC@active.ident)
               
                  0   1   2   3   4   5   6   7   8   9  10  11  12  13
  PBMC_ARD614   664 552 582 611 558 279 394 271 132 111  62 197  83  20
  PBMC_EarlyD27  43 127 271 104 124 107 436  50 193  26  25  54  28   4
  PBMC_Pre      370 184 218 105 476 332   1  65   3  47  77   8  10 186
  PBMC_RespD376 806 747 527 717 339 459  90 285  71 202 220  68 135  18

（9）可视化marker基因
作者选取了一些基因，这些基因在不同的免疫细胞群里是特异表达的：
"CD3D","CD3E", "TRAC", "IL7R", "GZMA", "FCGR3A", "CD14", "MS4A1", "FCER1A" 。

$ markerGenes <- c(
  "CD3D",
  "CD3E",
  "TRAC",
  "IL7R",
  "GZMA",
  "FCGR3A",
  "CD14",
  "MS4A1",
  "FCER1A" 
)
> FeaturePlot(object = PBMC, 
             features =markerGenes, 
             cols = c("grey", "blue"), 
             reduction = "tsne")

（10）把tSNE每一个分群加上细胞群名称
由于原文作者用的是Seurat v2进行分析，他得出了13个群，而我得到了14个分群，所以下面在命名的时候最后一个群我就直接以“13”命名（第一个群的编号是0）。

$ cat >celltype-patient1-PBMC.txt
0 "B cells"
1 "CD4+ T cells"
2 "Naive memory T cells"
3 "Classical monicytes"
4 "CD8+ effector T cells"
5 "NK cells"
6 "rm1"
7 "Non-classical monocytes"
8 "Dendritic cells"
9 "rm2"
10  "CD8+ cytotoxic T cells"
11  "Myeloid cells"
12  "rm3"
13  "13"
> names(new.cluster.ids) <- levels(PBMC)
> PBMC_V3 <- RenameIdents(PBMC, new.cluster.ids)
> DimPlot(PBMC_V3, reduction = "tsne", label = TRUE, pt.size = 0.5, cols = c('green4', 'pink', '#FF7F00', 'orchid', '#99c9fb', 'dodgerblue2', 'grey30', 'yellow', 'grey60', 'grey', 'red', '#FB9A99', 'black', '#c51b8a')) + NoLegend()

（11）按不同时间点绘制分群结果
先得到每个时间点都有多少细胞：

> TimePoints = PBMC@meta.data$TimePoints
> table(TimePoints)
TimePoints
  PBMC_ARD614 PBMC_EarlyD27      PBMC_Pre PBMC_RespD376 
         4516          1592          2082          4684

把不同时间点的细胞分别提取出来，这里要用到seurat包里的SubsetData这个函数。
先来看看这个SubsetData怎么用：

SubsetData(object, cells = NULL, subset.name = NULL,
low.threshold = -Inf, high.threshold = Inf, accept.value = NULL,
...)
object: 要先说明你要对哪个对象操作。
cells: 要说明你要提取这个对象里的哪些细胞。你可以指定列名，或者满足一定要求的细胞。如果这一项你不指定，将会按照下面三个参数的设置来提取满足要求的细胞。
subset.name: 要提取的子集的参数，例如：a column name in object@meta.data, etc.
low.threshold：参数的Low cutoff (default is -Inf)。
high.threshold：参数的High cutoff(default is Inf)。
。。。

#比如第一个子集，要取在PBMC里面meta.data里的timePoint这一项中PBMC_Pre这个时间点的细胞（下图有个截图，可以更直观的看到取的是什么
> PBMC_Pre= SubsetData(PBMC,cells=(PBMC@meta.data$TimePoints =='PBMC_Pre'))
#然后将这个子集可视化，存入一个变量figure1
> figure1= DimPlot(PBMC_Pre, reduction = "tsne", label = FALSE, pt.size = 0.5, cols = c('green4', 'pink', '#FF7F00', 'orchid', '#99c9fb', 'dodgerblue2', 'grey30', 'yellow', 'grey60', 'grey', 'red', '#FB9A99', 'black', '#c51b8a'))

#同理，把剩下的三个子集取出来，同样的处理
> PBMC_EarlyD27 = SubsetData(PBMC,cells=(PBMC@meta.data$TimePoints =='PBMC_EarlyD27'))
> figure2=DimPlot(PBMC_EarlyD27, reduction = "tsne", label = FALSE, pt.size = 0.5, cols = c('green4', 'pink', '#FF7F00', 'orchid', '#99c9fb', 'dodgerblue2', 'grey30', 'yellow', 'grey60', 'grey', 'red', '#FB9A99', 'black', '#c51b8a'))
> PBMC_RespD376=SubsetData(PBMC,cells=(PBMC@meta.data$TimePoints =='PBMC_RespD376'))
> figure3=DimPlot(PBMC_RespD376, reduction = "tsne", label = FALSE, pt.size = 0.5, cols = c('green4', 'pink', '#FF7F00', 'orchid', '#99c9fb', 'dodgerblue2', 'grey30', 'yellow', 'grey60', 'grey', 'red', '#FB9A99', 'black', '#c51b8a'))
> PBMC_ARD614=SubsetData(PBMC,cells=(PBMC@meta.data$TimePoints =='PBMC_ARD614'))
> figure4=DimPlot(PBMC_ARD614, reduction = "tsne", label = FALSE, pt.size = 0.5, cols = c('green4', 'pink', '#FF7F00', 'orchid', '#99c9fb', 'dodgerblue2', 'grey30', 'yellow', 'grey60', 'grey', 'red', '#FB9A99', 'black', '#c51b8a'))

然后我想把四个时间点的分群图并排的画在一起（因为文献里是同时展示了4张图，我之前也没试过，这次练习一下），要用到multiplot这个函数，这个函数是在Rmisc包（也有人说这个函数在ggplot2包里，但是我的ggplot2无法调用这个函数）。

> library(Rmisc)
> multiplot(figure1,figure2,figure3,figure4,cols=4)

这是我用Seurat V3分析后得到的不同时间点分群结果

这是文献里的原图，他用的是V2，会有一些不同，但我主要是走一遍流程，熟悉一下分析过程