设计荧光定量PCR引物的一般原则
1. 引物长度为20或21 bp；
2. 避免引物中连续出现5个或以上相同碱基，例如AAAAA或GGGGG；
3. 每条引物两端的碱基最好是G或C（GC碱基之间为三个氢键连接，保证引物与模板连接的稳固性）；
4. GC含量为45%~55%；
5. PCR产物大小为85~300 bp；
6. 如果目的基因有高度一致性的旁系同源蛋白，引物的3’端最后一个碱基一定要是SNP位点；
7. 有人建议其中一条引物要在5’UTR或3’UTR上。
设计步骤
以水稻OsActin1（LOC_Os03g50885 / Os03g0718100）基因为例，文献里报道的引物为
Actin-qF:TCTCTCTGTATGCCAGTGGTCGT；
Actin-qR: TCATAGTCCAGGGCGATGTAGG。
（1）下载OsActin1基因的转录本序列
进入Phytozome数据库，在1（物种）里选择水稻数据库（Oryza sativa v7.0 -rice），在2（find genes by keyword）里输入OsActin1基因的ID号LOC_Os03g50885；Enter进入搜索。
点击G（View gene report）,进入基因信息页面。向下滑动页面，到达Sequences栏即可（通过复制的方式）下载对应的序列。
另外也可进入RGAP 7数据库下载序列，不同的基因只需要将链接最后的ID替换为目的基因即可，点击Download Sequence，即可查看并下载目的基因的相应序列。
（2）NCBI设计定量引物
打开Primer-blast网站，复制OsActin1基因转录本5’端大约600 bp的序列进入PCR Template，在Primer Parameters栏的PCR product size属性中，将Min改为80，Max改为300，点击Get primers（最好勾选Show results in a new window），等待几分钟即可出引物。
（3）定量引物的筛选
一般而言，Primer-blast程序已经根据引物设计的一般原则设计出来的，所以所得到的每一对引物都可以使用，但是根据荧光定量PCR引物的一般原则，可以进一步选择适合自己需要的引物（个人倾向于选择靠近5’UTR的一对引物，并且引物的最后一个碱基为G/C，例如在这里第2对引物就很不错）。
（4）引物特异性验证
再次进入Primer-blast网站，将所得引物填入Primer Parameters栏的上下游引物框中，在Primer Pair
Specificity Checking Parameters一栏的Database选择Refsep RNA，物种选择水稻（taxid:39947）点击Get primers，等待几分钟即可出现结果。
那么该结果如何分析呢？如何知道自己自己的引物特异性好不好呢？
首先，“.”代表匹配上的碱基，一般而言，第一个完全匹配上的片段是自己的目的基因，后面的都是非特异性产物；在这里第2对引物就有多条非特异性产物，而且3’端比对上的碱基数较多，非特异性产物很可能扩出来，产物大小一样，从而影响定量结果的判断，所以第2对引物被排除。
接着我们选择第7对引物，发现非特异性产物的3’端的碱基数有些差异，很可能扩不出非特异性产物，可做候选引物，实在不行就选择最优的。
最后验证一下文献里用的引物，发现除了目的基因能扩出来外，无其他非特异性片段，所以这对引物特异性很好，可用于后续定量实验。
此外，个人还比较喜欢用MFEprimer-3.1在线工具来验证引物的特异性。在Primer sequences输入引物，在Background Database中选择水稻cDNA数据库，点击Run即可查看结果。
通过图11结果我们可以看到文献中的这对引物其实能扩出2个大小相同的引物，这是引物OsActin1基因的另一条链刚好有个基因，这影响不大，不必纠结，放心使用。
（5）定量引物验证
设计好的引物送去合成后建议不要直接去跑q，可以用cDNA先做一个普通的PCR，看是否扩出条带？扩出的条带大小是否正确？是否有杂带？只有完全没问题了再去上机看溶解曲线是否符合要求。
为了方便大家以及自己日后学习，在此提供本文的pdf文档。
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