Expression pattern of secretory-cell-related transcriptional signatures in colon adenocarcinomas defines tumor microenvironment characteristics and correlates with clinical outcomes
结肠腺癌中分泌细胞相关转录特征的表达模式定义了肿瘤微环境特征并与临床结果相关联
发表期刊：Mol Oncol
发表日期：2022 Nov 8
影响因子：7.449
DOI: 10.1002/1878-0261.13338
一、研究背景
肠粘膜中细胞增殖、分化和凋亡之间的平衡被破坏，导致粘膜稳态环境失调是结肠癌的早期征兆之一。在结肠粘膜的各种细胞类型中，分泌细胞代表了分化细胞的主要群体之一，由于这些细胞与不同的含粘液结肠癌组织学亚型密切相关，它们在驱动一部分结肠癌中的作用受到了广泛关注。
肠道内分泌细胞和腺泡细胞是两种主要的分泌细胞类型。两者都来自LGR5+多能干细胞，其分化途径受Notch信号控制。在生理上，为了应对腔内刺激，肠道内分泌细胞会分泌各种肽类激素，分别以传统的内分泌和旁分泌方式作用于远处的器官和邻近的细胞，而吞咽细胞会排出其粘蛋白颗粒，与水、盐和其他蛋白质结合。
此外，在肠道炎症期间，分泌细胞和免疫细胞之间的机理和生化交叉对话已被大量研究证实，这也促使分泌细胞在塑造结肠癌肿瘤微环境（TME）异质性中的潜在作用。因此，更全面地了解分泌细胞和免疫细胞之间的相互作用，将有助于加深我们对癌症免疫的理解。
二、材料与方法
1 、数据来源
1） GEO数据集：GSE17538、GSE33113、GSE37892、GSE38832和GSE39582
2） TCGA数据集
3） 中山大学肿瘤中心组织学诊断为非转移性结肠癌的30个新鲜样本的RNA测序数据，作为外部验证队列
2、分析流程
三、实验结果
01 - 与分泌细胞相关转录特征的表达水平相关的TME、生物学和临床特征
作者首先探讨了分泌细胞相关转录特征的表达水平在结肠癌患者肿瘤中的作用。如图1A所示，在meta-GEO和TCGA-COAD队列中，肠道内分泌细胞和亚型2吞噬细胞特征的表达水平存在明显的正相关，而亚型1吞噬细胞特征的表达水平则与上述两种细胞类型特征无关。在分泌细胞相关特征的PCA评分与TME细胞相关特征的相关性方面（图1A，左），发现在meta-GEO和TCGA-COAD队列中，肠内分泌细胞和亚型2型吞噬细胞特征的PCA评分都与基质细胞和一些骨髓细胞类型的评分表现出明显的正相关。相应地，肠道内分泌细胞和2型鹅口疮细胞特征的PCA评分与基质相关途径的激活水平之间也存在高度显著的正相关（图1A，右）。接下来的KEGG分析不仅证实了基质相关途径的激活程度与肠内分泌细胞和亚型2腺细胞的PCA分数之间的正相关，而且还发现亚型1腺细胞特征的估计分数与多种细胞代谢途径之间存在明显的正相关。在meta-GEO和TCGA-COAD队列中，比较不同共识分子亚型（CMS）中分泌细胞相关特征的富集程度，发现肠内分泌细胞和亚型2吞咽细胞特征的PCA得分在CMS4患者的组织中最高，这主要代表基质/间质表型；亚型1吞咽细胞特征的得分在CMS3患者的组织中最高，该亚型以突出代谢激活为特征（图1B)。
接下来探讨了结肠癌患者中分泌细胞相关特征的表达水平的临床意义。如图1C所示，与亚型腺泡细胞不同，其PCA评分与患者的生存率没有明显的相关性，而肠内分泌细胞和亚型腺泡细胞特征的水平较高，表明复发的风险明显较高。在总生存期（OS）中，发现肠内分泌细胞和2型小肠球菌细胞特征的PCA评分与OS时间的负相关关系仅在接受辅助化疗（ADJC）的患者中显著，这表明肠内分泌细胞和2型小肠球菌细胞的存在可能与化疗耐药有关（图1C）。为了验证这一假设，分析了GSE39582和TCGA-COAD队列中分泌细胞相关特征的PCA得分与化疗获益之间的关系（图1D）。结果显示，在具有高度富集的肠内分泌细胞和2型嗜酸细胞特征的患者中，ADJC增加了死亡率风险（图1D）。同时，在氟尿嘧啶无反应组中，肠内分泌细胞和亚型嗜酸细胞特征的富集水平明显高于氟尿嘧啶反应组，而亚型嗜酸细胞特征在氟尿嘧啶反应组中明显富集（图1E）。综上所述，这些结果表明，分泌细胞，特别是肠道内分泌细胞和亚型2腺泡细胞的富集水平可能是结肠癌预后和化疗反应的潜在预测因素。
02 - 识别分泌细胞相关的标志性表达模式
为了识别结肠癌中分泌细胞相关的特征表达模式，采用了无监督的K-均值聚类算法，该算法基于meta-GEO和TCGA-COAD队列中的肠内分泌细胞、1型嗜酸细胞和2型嗜酸细胞特征的PCA得分。如图2A,B所示，四种不同的分泌细胞相关特征的表达模式取得了最佳的聚类效果，并相应地将患者分为SCS1、SCS2、SCS3和SCS4亚型。其中，SCS1、SCS2和SCS3的样本对肠道内分泌细胞和亚型消化道细胞特征的富集程度分别为中等、最高和最低，而SCS4则对亚型消化道细胞特征表现出密集的富集。随后的生存分析显示，SCS2亚型患者的无复发生存期（RFS）明显短于其他SCS亚型的患者（图2C）。至于OS，与肠道内分泌细胞和2号亚型腺体细胞特征的PCA评分的单变量生存分析结果类似，在GSE39582（图2C,D）和TCGA-COAD队列中（图2E,F），SCS2只在接受ADJC的患者亚组中表现出明显比其他亚型差的预后。在化疗获益方面，森林图（图2G）和堆积直方图（图2H）显示，在GSE39582中，ADJC的表现使SCS2患者的死亡风险增加2倍以上。TCGA-COAD队列中，氟尿嘧啶反应率也是SCS2亚型患者中最低的。相比之下，肠道内分泌细胞和2号亚型腺泡细胞特征富集水平最低的SCS3患者对氟尿嘧啶的反应率最高。综上所述，这些数据表明，SCS2患者的临床特征主要归因于肿瘤组织中肠内分泌细胞和2号亚型腺泡细胞特征的高度富集。
由于分泌细胞相关特征的PCA分数已被证明与各类TME细胞相关特征的表达水平相关，进一步比较了SCS亚型中的TME细胞相关特征。基于PCA算法，发现SCS亚型显示出不同的TME细胞相关特征的富集（图3A-D）。在SCS2中，多种基质细胞和具有免疫抑制特性的先天免疫细胞，如成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞的PCA得分显示出最高水平。这表明SCS2样本的TME可能被归类为 "免疫排斥"表型的特征。相比之下，SCS3的TME特征与 "免疫沙漠 "表型相似，因为大多数TME细胞特征在SCS3样本中的富集程度最低。几乎所有TME细胞类型的PCA得分在SCS1样本中都显示出中等水平。此外，发现与其他亚型相比，SCS2的瘤内异质性最高（图3E），肿瘤纯度最低（图3F）。然而，不同SCS亚型之间的肿瘤突变负担（图3G）和新抗原数量（图3H）没有明显差异。
然后，通过对标志基因和KEGG基因集进行PCA算法，研究了与每个SCS亚型相关的通路激活情况。如图3I-L所示，基质相关通路和炎症相关通路在SCS2患者中被高度激活，但在SC3患者中被明显抑制。此外，KRAS信号传导在SCS2患者中被高度激活，表明KRAS信号传导可能在SCS2肿瘤的进展中发挥重要作用。最后（图3M,N），发现SCS2患者主要集中在显示基质特性的多个亚型，包括HMC4、C4（CIT）、CMS4、TMEC2、Sub 3和C6（Pan-Immune，TCGA）亚型，而几乎所有SCS4患者都富集在CMS3。然而，在GSE39582和TCGA-COAD队列中，不同SCS亚型患者的错配修复（MMR）或微卫星不稳定性（MSI）状态的分布并不一致。总之，这些结果表明，SCS2患者主要表现出基质相关的TME和生物学特征，这可能是该亚型患者化疗抵抗的原因之一。
为了更好地了解不同SCS亚型的生物学特征，作者在TCGA-COAD队列中进行了多组学分析。首先，关于SMGs在不同SCS亚型中的有效突变分布，发现KRAS在整个、MSI高（MSI-H）和微卫星稳定/MSI低（MSS/MSI-L）患者队列中SCS4亚型的突变率最高（图4A），并且KRAS突变与1亚型腺泡细胞特征的PCA评分高度相关（图4B）。有趣的是，在整个和MSS/MSI-L队列中，SCS4亚型的TP53突变率明显低于其他SCS亚型（图4A），TP53突变与预测的氟尿嘧啶AUC值高度相关（图4B）。值得注意的是，在MSS/MSI-L队列中，与其他SCS亚型相比，BRAF突变在SCS2患者中明显富集。
除了基因组突变外，还探讨了SCS亚型之间基因启动子甲基化水平的差异。如图4C所示，共发现36个SVMG。在这些基因中，HYAL1、CAPN8、REG4和NAT2的甲基化程度高，转录表达量低，而其他基因的甲基化程度低，SCS2亚型的转录表达量高，这表明这些基因的甲基化可能在SCS2患者的生物学特征中起重要作用。这些SVMG的甲基化水平与分泌细胞相关特征的PCA得分和预测的氟尿嘧啶AUC值的关联见图4D。
最后，从TCGA-COAD队列中下载了蛋白质组学数据。与转录组分析结果一致（图4E,F），SCS2亚型中纤维蛋白和IV型胶原蛋白等间质标志物的蛋白表达量很高，而上皮标志物E-cadherin的蛋白表达量明显下降，这进一步证实SCS2在蛋白水平上存在基质途径的高度激活。
03 - 在meta-GEO队列中构建SCS评分并探索其临床相关性
由于SCS2亚型的患者预后较差，不能从氟尿嘧啶治疗中获益，作者认为有必要开发一个简单的评分工具，以准确识别临床实践中的此类患者，并协助TNM分期，指导结肠癌的ADJC表现。在GSE39582队列中确定了628个DEGs，并先后使用Boruta降维和LASSO-Cox回归分析，建立了由七个基因组成的评分模型，称为SCS评分（图5A）。在这些基因中，ASCL2和FAM84A在SCS2亚型中下调，其表达水平与复发风险显著负相关。其他五个基因在SCS2患者中高表达，它们的过度表达与较差的RFS明显相关（图5B）。小提琴图显示（图5C），SCS评分的中位数在SCS2中最高，其次是SCS1亚型，而SCS3患者的评分最低。接受者操作特征（ROC）曲线分析进一步表明，SCS评分是区分SCS2亚型患者的可靠指标，诊断准确率为0.96（图5D）。通过相关试验（图5E），发现SCS评分与肠道内分泌细胞和2型嗜酸细胞的PCA评分、氟尿嘧啶反应的AUC和SIIS值高度正相关，说明SCS评分是一个能反映肠道内分泌细胞和2型嗜酸细胞特征丰富程度的有效指标，与氟尿嘧啶耐药有关。此外，SCS评分与基质途径和基质细胞特征表达明显正相关（图5F），在dMMR患者中也明显升高，这与SCS2亚型的结果一致。
接下来，探讨了SCS评分在指示结肠癌患者的预后和化疗获益方面的作用。首先使用survminer软件包将患者分为高和低SCS评分组，发现低SCS评分组的RFS（图5G，左）和OS（图5G，右）明显较高。对SCS评分作为连续变量的进一步分析显示，SCS评分是RFS的一个独立预后因素。然而，在单变量（图5H）或多变量分析中，SCS评分和OS之间的明显相关性仅存在于接受ADJC的患者亚组。就SCS评分在预测化疗获益方面的作用而言，作者根据ROC曲线重新定义了SCS评分的临界值，以衡量SCS评分在识别SCS2亚型方面的准确性。只有SCS评分低的患者可以从ADJC中获益（图5I）。总之，上述结果显示，SCS评分是预测结肠癌患者预后和化疗效果的有用生物标志物，具有良好的临床转化价值。
为了证实SCS评分的临床价值和生物学意义，在TCGA-COAD和SYSUCC队列中探讨了SCS评分的作用。结果显示，TCGA-COAD队列中SCS评分在不同SCS亚型中的分布与meta-GEO队列中的分布一致（图6A），在TCGA-COAD队列中，SCS评分在识别SCS2亚型中患者的AUC值为0.96（图6B）。此外，与meta-GEO队列的结果一致，在TCGA-COAD（图6C,D）和SYSUCC（图6E,F）队列中都观察到SCS评分与基质相关和炎症相关途径的激活水平呈正相关；肠内分泌细胞、2型吞咽细胞、基质细胞和骨髓细胞的PCA评分，以及氟尿嘧啶反应的AUC值。值得注意的是，在TCGA-COAD队列中也观察到MSI-H患者的SCS评分的升高。对TCGA-COAD队列的进一步生存分析也显示，较高的SCS评分与较高的死亡率显著相关（图6G）；然而，在ADJC亚组中，SCS评分在单变量（图6H）和多变量Cox回归中作为连续变量都与OS明显相关。SCS高分组的患者也无法从ADJC中获益（图6I）。这些结果表明，SCS评分模型有很强的可重复性。
在此，作者使用TIDE算法来预测对免疫疗法有反应的可能性。与其他SCS亚型相比，SCS2患者可能更不可能对免疫疗法有反应，在GSE39582（图7A，上）和TCGA-COAD队列（图7A，下）中的无反应率都是最高。一致的是，在GSE39582、TCGA-COAD和SYSUCC队列中，SCS评分在预测的免疫疗法无反应组中明显上调（图7B），并与TIDE评分明显正相关（图7C）。除了TIDE预测，还使用SubMap将定义的SCS亚型的表达谱与已发表的包含217名接受抗PD-L1治疗的转移性尿路上皮癌患者治疗前转录组数据的数据集进行比较。发现SCS2亚型的样本与抗PD-L1无反应组的样本在标记基因表达上有明显的相似性（图7D），这进一步表明SCS2患者可能不是可以从ICB中获益的候选人。
04 - SCS2亚型样本中氟尿嘧啶抗性的候选驱动基因
在以前的研究中，作者通过对SW480细胞进行基于CRISPR的全基因组功能缺失筛选，确定了几个介导结肠癌化疗耐药的驱动基因。为了探讨这些驱动基因是否参与了介导由肠道内分泌细胞和2型小球细胞富集引起的氟尿嘧啶抗性，首先分析了GSE39582和TCGA-COAD队列中SCS2（肠内分泌细胞和2型小球细胞丰度最高，氟尿嘧啶反应率最低）和SCS3（肠内分泌细胞和2型小球细胞丰度最低，氟尿嘧啶反应率最高）之间的DEGs，然后得到DEGs与CRISPR文库筛选的潜在驱动基因组的交叉点。结果确定了七个核心基因，其sgRNA在氟尿嘧啶处理的存活细胞群中明显增加，并且在meta-GEO和TCGA-COAD队列中SCS2亚型的表达明显增加（图8A-C）。定义了一个名为CRISPR评分的新变量，其数值是通过对这七个基因的表达值进行加总而得到的。相关分析显示（图8D-G），CRISPR评分也与GSE39582、TCGA-COAD和SYSUCC队列中的肠内分泌细胞、亚型2腺细胞、多种基质和骨髓细胞以及基质途径的PCA评分、氟尿嘧啶反应的估计AUC和SCS评分值明显正相关。临床分析进一步表明，在接受ADJC的患者中，CRISPR分数高的患者比CRISPR分数低的患者表现出较差的预后（CRISPR分数作为一个连续变量进行分析，图8H）。同样，还发现，ADJC的表现增加了高CRISPR评分亚组的死亡风险（图8I）。总之，根据这些真实世界队列的分析结果，认为这七个基因可能以高度协调的方式驱动SCS2患者的化疗抵抗。
由于单纯的化疗可能无法使肠道内分泌细胞和2型腺细胞富集水平高的患者受益，作者探讨了可用于SCS2亚型患者的化疗增敏的潜在化合物。通过分析CTRP数据库中化合物的AUC与GSE39582、TCGA-COAD和SYSUCC队列中SCS评分之间的相关性，确定了19个化合物，其与SCS评分的相关系数在三个队列中同时小于-0.5（图8J）。对这些化合物的基因靶点（图8K，顶部）和活性（图8K，底部）的进一步分析表明，有6个是PI3K激酶家族成员的抑制剂。其中，XK765针对多种PI3K催化亚基；TGX-221和AZD6482都能抑制PIK3CB的活性，而AZD6482、CAL-101和TG-100-115主要抑制PIK3CD的活性。这些发现为开发SCS2患者有效的化学增敏治疗策略提供了一个新的视角。
四、结论
该研究全面揭示了与分泌细胞标志物转录表达富集有关的临床行为、TME和生物学行为的异质性。此外，SCS评分是一个容易获得的模型，可用于识别SCS2患者，这是一组具有特殊临床特征的患者。
