在植物免疫领域，2020-2021年爆发了大量整合ETI和PTI免疫通路的研究。探究ETI和PTI的共调控也成为了各大植物免疫实验室的研究热点。今天分享一篇水稻免疫通路的研究。该研究整合了植物病理、分子遗传、生化生理等研究策略，发现了同时参与PTI和ETI免疫通路的关键蛋白，鉴定出一条新的免疫代谢通路。由于本文篇幅很长，所以划分成两部分分享：NLR调控两大传统免疫，NLR调节乙烯代谢通路。
文章信息
- 题目：NLRs guard metabolism to coordinate pattern- and effector-triggered immunity
- 期刊和时间：Nature，2021.12.16
- 作者和单位：中国科学院分子植物科学卓越创新中心何祖华研究组
研究背景
- 植物的免疫系统分为Pattern-triggered immunity (PTI) 和efector-triggered immunity (ETI)两个部分，用以感知体外的病原物入侵。
- 蛋氨酸（Methionine ，Met）是乙烯的合成前体。病原菌经常挟持乙烯以促进自己定殖。
- 虽然初级代谢物已经被认定参与了植物的防御，但它们的免疫功能以及NLR蛋白激活其生物合成的机制尚不清楚。
- 稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）在侵染时会释放effector到植物细胞，NLR蛋白会识别effector。但是NLR蛋白如何引发广谱抗性的机制尚不清晰。
研究结果
1.PICI1在ETI中的功能
科研人员首先从NLR蛋白PigmR入手。PigmR是一个整合ETI和PTI免疫调节的蛋白。作者利用酵母双杂找到了与PigmR互作的蛋白库；用蛋白质组学找到受到几丁质诱导的蛋白库。二个筛选得到的蛋白库取交集定位到了3个蛋白。由于其具有前面两种筛选属性，因此这三种蛋白被命名为PICI蛋白（PigmR-interacting and chitin-induced proteins, PICIs）。实验具体流程可见下方流程a。
往后，作者针对PICI1进行跨物种同源基因的多序列比对，发现PICI1有一个PPPDE域，预测出来是一个去泛素化酶。为后文埋了个伏笔。紧接着作者用酵母双杂谈久了PigmR与PICI1的互作模式，发现PigmR是通过C端和PICI1互作（Figure1a，在下方）。PICI1与其他NLR蛋白例如Pi9和Piz-t都有类似的C端结合模式。
接下来作者在日本晴背景下构建了PigmR的近等基因系（NIL-Pigm）。并在此基础之上构建了PICI1的敲除系（PICI1-KO）和过表达系（PICI1-OE）。更牛逼的是作者在ZH11背景（自带Piz-t）下构建了PICI1-KO/ZH11。在Ky-Pi9背景下（自带Pi9）构建了PICI1-KO/Ky-Pi9。并且进行了抗性接种检测，结果如下。
注解：上文提到PICI1与Pi9和Piz-t有类似的C端结合模式。作者构建的几株突变体相当于创造了含有特定NLR蛋白，却不含有其相应互作蛋白PICI1的个体，也就是认为破坏了PICI1与Pi9或者Pizt的互作。结果发现敲除了PICI1之后含有Pi9的个体和Pizt的个体黄色病斑减少，免疫响应下降。说明了PICI1参与了两种NLR蛋白互作，从而参与ETI调节。
2.PICI1在PTI中的功能
首先，作者发现在PICI1-KO突变体中几丁质诱导的ROS爆发下降。 PICI1-OE中ROS增加（Fig1d）。作者也引入了TM21作为PTI诱导物，与几丁质呈现出了相似的结果（Fig1c）。作者也对几丁质所诱导的PICI1mRNA积累和蛋白积累进行了time-course探究（Fig1e）。综上所述， PICI1-KO增强了致病性, 但PICI1-OE增强了感病性。
3.PICI1是一个去泛素化酶
接下来作者要回收上文的伏笔，上文我们提到预测PICI1中有PPPDE域，可能是一个去泛素化酶。第115位半胱氨酸（Cys）是PICI1的关键氨基酸位置。因此作者将PICI1蛋白，PICI1蛋白的PPPDE域和带有115位点半胱氨酸突变成丝氨酸的PICI1分别整合到His上（即His-PICI1，His-PICI1-PPPDE，His-PICI1（C115S）），并进行了去泛素化荧光分析（Figure2，在下下方）。
补充一下泛素的相关背景：
泛素（Ubiquitin，Ub）对蛋白质的翻译后修饰，对它们的区室化，降解和功能产生了深远的影响。单个Ub与靶蛋白的结合被称为单泛素化，另外的Ub部分可以与该初始Ub缀合，形成多聚泛素（polyUb）链。这些polyUb链通过Ub的C末端与靶蛋白的赖氨酸之间形成异肽键而连接。PolyUb链本身通过各个单体Ub单元之间的类似缀合机制形成，并且可以通过Ub中存在的所有赖氨酸（K6，K11，K27，K29，K33，K48和K63）连接。 两种表征的最充分的多泛素化形式是通过连接在赖氨酸48（K48）或赖氨酸63（K63）上发生的。K48连接多聚泛素化最常见的后果是蛋白酶体介导的降解，而K63连接的多泛素化修饰与其他细胞过程有关，DNA损伤反应的调节，胞内分选，错误折叠/聚集蛋白的自噬和神经变性。
4.PICI1可稳定蛋氨酸合酶（OsMETS）并使其去泛素化
为了鉴定PICI1直接的下游底物，作者进行了质谱分析（IP-MS）得到了20个泛素修饰的蛋白。这其中就有Met synthase（OsMETS）。CO-IP实验证实了二者的互作（Fig2c）。接下来作者验证了PICI1对OsMETS积累的影响（Fig2d）。Fig2d的实验也证明只要PICI1的C端出现就能稳定OsMETS的积累，二者的互作区域在C端。
注解：图A是去泛素化荧光分析。在这里作者用的泛素底物是Ubiquitin 7-amido-4-methylcoumarin(Ubiquitin-AMC)。一旦泛素被去泛素化酶解离，与泛素相连的荧光物质AMC就会被释放，从而呈现出荧光，荧光强度越强代表去泛素化越强，即图A，可见有PICI1完整蛋白和PICI1的PPPDE域都能去泛素化，但是C115位突变则不能去泛素化。图B进一步检验了PICI1-KO敲除突变体的去泛素化能力。K48和K63是两种偶联泛素，可以与蛋白相应位点赖氨酸相连。敲除掉PICI1导致去泛素化活性减弱，因此解耦合所释放的K48和K63就会减少，以证明PICI1的去泛素化酶活性。图C的CO-IP实验进一步验证了OsMETS与PICI1的互作。图D作者用了26s蛋白酶体MG132以保护OsMETS的稳定性，相当于第二列泳道证明了样本中所有的OsMETS量应该是2.1个灰度，而正常代谢的情况下（第一列）是1.0个灰度，但是当正常代谢时加入了PICI1的C端则积累量为1.8个灰度，相比起没有PICI1时积累量增加。图E作者加入了仅含有K48位点或仅含有K63位点的泛素，结果发现PICI1在wt和K48O的情况下减少了OsMETS的泛素化，但是在K63O中没有变化。接下来作者把OsMETS的标签换成GPF单独看OsMETS-GFP受泛素化调控的情况，结果同样证明了K48O减少了OsMETS的泛素化（图F）。图G讲的是PICI1能够延迟OsMETS去泛素化，而PICI1（C115S）不能延迟去泛素化。不过这里面input做的一般般，mcherry条带的第二列明显比其他带深。最后一张图I作者加入了先前构建的PICI1-KO突变体，检测OsMETS积累量。证实了PICI1-KO能够增强K48O对OsMETS的调节，再一次验证上述观点。long和short代表长曝光和短曝光。
参考信息：
1.Zhai, K., Liang, D., Li, H. et al. NLRs guard metabolism to coordinate pattern- and effector-triggered immunity. Nature (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-04219-2
2.K48-连接的多聚泛素的分离和富集：升级版K48 TUBE. https://zhuanlan.zhihu.com/p/88493344
