在经过一段时间对单细胞转录组和空间转录组相关技术的了解，我认为对两项技术在生物领域的应用有了一定的认知。本周我选择从植物领域入手，选择了华大在今年五月份于Developmental Cell在线发表的拟南芥叶片空间单细胞的一个关联分析研究。接下来我带大家一起认知和解读这篇文献吧。

一、文章简介

文章题目：单细胞空间转录组测序揭示拟南芥叶片中特定区域的细胞亚型和转录组图谱

期刊：Developmental Cell IF：13.417

发表机构：深圳华大生命科学研究院

二、主要内容

研究者通过对6周龄的拟南芥茎生叶进行了取样、实验和测序分析，在验证scStereo-seq技术在植物样本中应用的可靠性的同时，分析了拟南芥叶片中不同基因的空间表达变化以及不同细胞群体的空间发育轨迹，描绘了叶片中不同细胞类型的转录组空间变化。

研究的内容主要包括以下几点：

l 利用stero-seq技术建立植物单细胞空间转录组图谱

l 鉴定细胞亚型和细微的转录差异

l 从主脉到叶缘细胞类型差异基因的表达

l 构建拟南芥空间图谱来分辨维细胞发育轨迹

三、材料与方法

研究样本：样本为6周龄的拟南芥茎生叶，拟南芥品种为野生型Columbia-0。

研究策略：基于华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq，深圳华大生命科学研究院结合植物样本拥有细胞壁这一特性，针对技术流程进行了优化和改良，建立了一套适用于植物的单细胞级的空间转录组技术流程scStereo-seq，并将其示范应用于拟南芥叶片的时空组学研究中。

Stereo-seq技术的建立和应用（图1）：

① CID经滚环扩增后形成DNA纳米球（DNB）

②DNB落入芯片上的spot位点，经测序得到CID序列及空间坐标

③ 通过生化合成将CID与MID分子和捕获探针（Oligo-dT）相连接

④ 组织切片贴片后透化并释放mRNA

⑤ 芯片对组织上的mRNA进行原位捕获，经扩增后建库测序

图1 scStereo-seq技术原理示意图

实验方法：

① 对拟南芥叶片进行冷冻切片，使用直径为220nm, 间距为715nm的DNA纳米球（DNB）阵列来捕获mRNA信息。

② 对切片进行细胞壁染色呈像，使用stereo-seq技术对11片叶子进行测序实验。

③ 确认测序确认质量达到要求，MID 的分布可以在组织区域和背景区域间明显区分开来。

④ 对细胞壁进行了甲苯胺蓝(TB)染色，以显示细胞间的边界。

⑤ 将染色图像和测序数据合并，利用套索工具根据细胞壁边界手工提取单细胞，并与MID计数相配合，获得每个单细胞的具体数据。

四、研究结果

1、scStereo-seq技术的建立和应用

基于Stereo-seq技术，研究者建立了适用于植物的单细胞空间转录组技术（scStereo-seq），并将其应用于植物叶片样本研究中（图2A）。通过取样、实验和分析筛选，研究人员筛选出来26个拟南芥叶片样本进行了整合以及基础数据集的构建，通过质控和过滤，总共获得了13,950个单细胞数据用于后续分析，包括5,139个表皮细胞、7,490个叶肉细胞、377个保卫细胞和944个维管束细胞。

                                                        图2 拟南芥茎叶单细胞水平空间转录组的分析

2、单细胞水平上鉴别细胞类型间的转录组差异

在获得高质量高数据量的叶片空间数据（图2A）后，研究者首先对scStereo-seq技术在植物样本中应用的可靠性进行了验证。通过marker基因的检验和可视化、单细胞聚类分析、主要细胞类型鉴定和功能分析等方法多方面地进行了分析，结果发现scStereo-seq技术能够提供高清的细胞内转录组特征，对不同细胞类型的鉴定具有较高的分辨率（图3C、2E、2F）。

                                                        图3 不同细胞类型的技术再现性和转录组多样性

3、评估scStereo-seq技术在植物样本中应用的可靠性

在过往的植物单细胞研究中，部分细胞亚型特征高度相似而难以通过单细胞等技术得到有效地区分和研究（如表皮细胞中的上、下表皮细胞，叶肉细胞中的栅栏细胞和海绵细胞），而scStereo-seq技术可以在获得单细胞空间表达数据的同时，根据切片的图像信息对切片样本中形态清晰的细胞进行鉴定和注释。通过将空间信息与转录组数据结合分析，成功将表达相似的上、下表皮细胞（图4C），以及栅栏细胞、海绵细胞区分开来，并对这些相似细胞类型间的差异和功能（图4D、4E）进行了研究。

                                                   图4 细胞类型和细胞亚型转录组特征的验证和研究

4、解析从主脉到叶缘细胞类型差异基因的表达

为了探究基因的空间表达差异，研究人员从叶片中间向两端的方向划分成了4个区域（0区为主叶脉，3区为叶边缘），并以此为基础在细胞中进行了基因表达模式分析（图5A），结果表明，光合作用效率从主叶脉到叶缘逐渐增加，而主叶脉的主要角色是与物质运输相关（图5B~4D）。鉴于光合作用过程主要发生在叶肉细胞当中，研究人员又进一步对叶肉细胞中的基因表达模式进行了分析，分析结果与之前的分析一致。有意思的是，叶肉细胞的pattern2和pattern 3的基因显著富集于物质运输与高渗机械刺激等反馈相关的GO中，表明0区的叶肉细胞与维管细胞之间可能存在较为频繁的物质交换（图5E~5G）

                                                               图5 拟南芥叶片横截面上的基因表达模式

5、解析不同类型细胞的空间发育轨迹

已有研究表明，叶脉与叶边缘的细胞存在分化上的差异，但不同类型细胞的具体发育模型还不清楚，通过拟时序分析，研究人员发现在维管细胞中，主叶脉区域的细胞相较于叶缘其分化程度更低，拥有更高的多功能干性（图6A~6C）。而在表皮和保卫细胞中，保卫细胞显著富集于发育轨迹的一支，但它们在空间上没有表现出明显差异（图6D~6F）。

                                                        图6 血管细胞和保卫细胞的空间分辨发育轨迹

五、研究总结

这篇文章总体而言是一篇技术推广文章。主要目的是证明了华大开发的scStereo-seq时空转录组技术的可用性。通过在拟南芥叶片中运用scStereo-seq技术，证明单细胞分辨率的空间转录组技术其有利于细胞类型的识别和细胞转录特征的鉴定。其中利用空间信息和基于图像的单细胞分割有利于细胞亚群的鉴定，给我们在植物上将单细胞和空间技术进行整合提供了借鉴。