刘小泽写于18.11.18
好资料值得花时间学习，即便是英文版。limma的学习资料有很多，我每次更新的也是不同的内容，希望能多涉及一些关于limma的知识，充实大脑
最近经常从花花那里听说.jpg，被感染了哈哈😂
配置
之前果子更新了一篇推送，讲的就是bioconductor的安装方式发生了改变。我们之前直接source+install.package安装，现在用到了biocmanager。刚开始转换还遇到了一点问题，可能是网络原因吧，总提示安不上biocmanager。但是有问题不能怕，相信“一切软件问题都不是问题”，只要电脑还健在，就可以解决
# 先安装BiocManager，它位于CRAN
if(length(getOption("CRAN"))==0) options(CRAN="https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/")
if(!require("BiocManager")) install.packages("BiocManager",update = F,ask = F)
# 然后添加BioC的国内源，可以选清华或者中科大
if(length(getOption("BioC_mirror"))==0) options(BioC_mirror="https://mirrors.ustc.edu.cn/bioc/")
# 这就是最新的安装方式了
if(!require("limma")) BiocManager::install("limma",update = F,ask = F)
# 再安装一个数据包（关于白血病的）、
if(!require("leukemiasEset")) BiocManager::install("leukemiasEset",update = F,ask = F)
前言
LIMMA的意思原来是“linear models for microarray data”，这也就解释了为什么其中有构建线性模型的步骤【线性模型包括了线性回归、多重线性回归、方差分析等】另外limma是为芯片而生。但不仅止于此，后来衍生的limma-voom也依然成了今天转录组差异分析的金标准。另外DNA甲基化也可以用limma去分析（当然我现在还没有涉及这部分）
使用limma需要有一个代表某种测量的数值矩阵，比如基因表达矩阵（一般就是行为feature，列为sample）或者组蛋白修饰、Hi-C contact matrix。这里feature可以代表许多含义，在样本信息中（比如GEO得到的样本信息数据框）一个feature表示一个样本，在表达矩阵中一个feature就等于一个基因，另外还可以表示基因组区间（比如不同的启动子promoters或者基因重叠区域 genomic bins）。不论是limma还是deseq2或者是edgeR，都采用了经验贝叶斯方法获取feature信息。
我们这里只讨论基因表达数据，包括芯片和转录组数据，这种数据中一般样本数量在100以内，最多一般也不超过1000，并且样本是有分组的，最常见的就是对照组control和处理组case。我们分析的目标也就是找到不同组之间差异的features（genes）。
但是并非每次都是两组比较，有时涉及到更多信息，比如年龄、性别；然后还有更复杂的，就是时间序列信息，所有的样本是按照时间点划分的，每个时间点为一个组，包括了几个样本。因此，一个实验的design矩阵 就是组间样本是如何分布的。样本一般是相互独立的，但是有时也是成对出现，比如同一个病人的正常与癌变组织就是这样一对样本。最常见的design就是两个未成对的组之间的比较。
两组比较 A two group comparison
获取数据
# 使用的是一个表达数据集ExpressionSet=》leukemiasEset
library(leukemiasEset)
data(leukemiasEset) #使用data来加载这个数据集
table(leukemiasEset$LeukemiaType)
得到结果如下：这是4组不同的白血病和1组对照的样本信息，其中NoL意思是不是白血病（Not leukemia）即正常对照组
##
## ALL AML CLL CML NoL
## 12 12 12 12 12
如果想知道ALL型白血病与对照组之间的差异基因，可以先取出相关的子集ALL和NoL
myData <- leukemiasEset[, leukemiasEset$LeukemiaType %in% c("ALL", "NoL")]
myData$LeukemiaType <- factor(myData$LeukemiaType)
# 这里你会看到，虽然myData只包含了ALL和NoL两种type，但是显示的因子还是5种，因此需要重新赋值一下因子类型
myData$LeukemiaType <- factor(myData$LeukemiaType)
线性模型
现在做一个标准的limma model fit
design <- model.matrix(~ myData$LeukemiaType)
fit <- lmFit(myData, design)
fit <- eBayes(fit)
topTable(fit)
首先，为了比较感兴趣组的样本（这里的ALL和NoL），我们用model.matrix构建了design矩阵（叫design可以理解为是从实验设计角度出发），这里的design矩阵有两组【多组的需要稍微变一下构建方法】；
其次，拟合线性模型（line model fitting），然后利用经验贝叶斯方法【这是limma的核心所在】 得到基因间强度关系（gene strength），因为这个实验矩阵（design）只有两组，因此只有一种比较方法：即比较他们之间的基因差别；
然后，使用topTable函数列出差异表达最显著的基因【如果实验设计比较复杂，还需要告诉topTable比较哪些interest特征】
得到的结果部分如下：
logFC AveExpr t P.Value adj.P.Val
ENSG00000163751 4.089587 5.819472 22.51729 9.894742e-18 1.733025e-13
ENSG00000104043 4.519488 5.762115 21.98550 1.718248e-17 1.733025e-13
ENSG00000008394 5.267835 7.482490 20.08250 1.374231e-16 9.240332e-13
- 其中一个重要的部分是logFC，也就是case与control组之间的log Fold change值，这里有个注意事项：你需要知道样本组比较顺序（是ALL-NoL还是NoL-ALL）。如果是前者，那么logFC为正就说明相对NoL，基因在ALL是高表达的。因此判断哪个样本为reference是很重要的。那么如何判断？
myData$LeukemiaType
## [1] ALL ALL ALL ALL ALL ALL ALL ALL ALL ALL ALL ALL NoL NoL NoL NoL NoL
## [18] NoL NoL NoL NoL NoL NoL NoL
## Levels: ALL NoL
就看上面这个代码的结果中的Levels部分哪个因子首先出现，它就作为reference
这里的结果是ALL先出现，因此ALL组是reference，也就是NoL-ALL的模式，这样的话，如果得到的logFC是正值，那么就说明在ALL组中基因表达下调
如果想要改变reference组，可以用relevel()函数
- 另外结果还包括t检验数据、P值（P.Value 对于多组比较未校正）、校正的P值（adj.P.Val 默认使用Benjamini-Horchberg方法对多组进行P值校正）
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