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Introduction
在脊椎动物中，因损伤或病变而失去组织的再生能力是普遍存在的，但不是均匀分布的。一些动物，如硬骨鱼，可以再生各种器官，包括截断的附属物、心室和脊髓，而其他动物，如哺乳动物则不能。尽管再生已经成为广泛的系统进化、发育、细胞和分子研究的主题，但动物再生能力的广泛差异所依据的机制仍然难以确定。顺式调控元件的变化已被证明是形态多样性的一个主要来源。新的证据表明，损伤依赖性基因的表达可能由损伤应答的增强子元件控制。然而，去除斑马鱼（Danio rerio）和果蝇的这些之前鉴别的元件的表明，它们通常对再生是可有可无的。因此，脊椎动物的基因组中是否存在保守的再生应答元件，而不是损伤应答元件，以及它们是如何进化的，仍有待证明。
Rationale：
识别保守的再生应答增强子（RREs）需要两个近缘但有进化距离同时具有再生能力的物种。斑马鱼和非洲鳉鱼（Nothobranchius furzeri）之间生活史的巨大差异和约2.3亿年的进化距离提供了一个独特的生物背景，能够区分物种特异性和保守的RREs。我们推断，应用H3K27ac（ChIP-seq，活跃增强子的标志）、bulk RNA-seq 和scRNA-seq能够鉴定被截肢激活的RREs，并有助于确定其在单细胞水平上靶基因的表达。此外，我们利用非洲鳉鱼快速性成熟的优势，快速生成转基因报告分析，以验证预测的RREs，并促进其在成年再生中的功能测试。
Results
我们发现鳉鱼和斑马鱼对截肢的基因组应答存在很大差异，而且进化上保守的硬骨鱼再生反应程序（RRP）主要由再生特异性囊肿细胞部署。生物信息学分析显示，RRP的激活包括斑马鱼中已知的再生效应物，如抑制素βA（inhba），在哺乳动物中被不同程度地激活，包括强的（Acomys cahirinus）和弱的再生者（Mus musculus）。通过对来自鳉鱼、斑马鱼和人类的保守的inhba RRE进行系统的转基因报告测试，确定了物种的特异变化。鳉鱼inhba RRE的缺失明显扰乱了尾鳍的再生，破坏了心脏的再生。此外，inhba RRE的活动需要存在预测的activator protein 1（AP-1）复合物结合的motif。最后，在本研究报告的保守和非保守的硬骨鱼RRE中可以确定AP-1的结合motif，这表明AP-1可能对损伤和再生反应都是必需的。
Conclusion
我们为进化过程中再生能力的丧失提出了一个基于RRE的模型。在我们的模型中，富含AP-1的RREs的祖先功能是激活一个再生反应，包括损伤和再生。在进化和物种分化的过程中，再生和损伤反应在一些但不是所有的增强子中变得彼此不相干。在现存物种中，有再生能力的动物保持着祖先的增强子活性，以激活损伤和再生反应，而在没有再生能力的动物中，对祖先增强子的重新利用可能导致损伤反应活性的保留，但再生反应的丧失。
ARTICLE
再生在脊椎动物中的分布是不均匀的，而这种差异的遗传机制仍然难以捉摸。两种相关的硬骨鱼的表观基因组比较分析和单细胞测序发现了对再生的物种特异的和进化上保守的基因组应答。这种保守的应答揭示了几个再生应答增强子（RREs），包括Inhba的上游元件，这是脊椎动物再生的一个已知效应器。该元素在再生的转基因鱼中激活了表达，其基因组的缺失扰乱了尾鳍的再生并完全废除了心脏的再生。该增强子存在于哺乳动物中，共享具有功能重要性的activator protein 1（AP-1）binding motif，对损伤有反应，但不能拯救鱼类的再生。我们提出，富含AP-1的RREs的变化可能是脊椎动物丧失再生能力的一个重要来源。
损伤后的再生在脊椎动物中分布广泛但不均匀（1）。例如，硬骨鱼和蝾螈可以再生各种器官，包括截断的附属物、心室和脊髓，而哺乳动物则不能（2，3）。此外，再生的能力只限于某些物种的早期发育阶段（4，5）。虽然再生能力差异的遗传机制仍然难以捉摸，但人们普遍认为顺式调控元件/增强子的变化是形态学多样性的主要来源（6，7）。新的证据表明，损伤依赖性基因表达的激活可能是由损伤应答增强子元件诱导的（8）。两个这样的元素，斑马鱼的瘦素-b（lepb）增强子和果蝇的WNT基因簇BRV118增强子，已被证明在损伤后能调节基因表达。然而，斑马鱼的lepb或苍蝇的WNT增强子的去除表明，这些损伤反应元件一般对再生是不需要的（8, 9）。因此，脊椎动物基因组中是否存在保守的再生应答的元件，而不是损伤应答元件，以及它们是如何进化的，仍有待最后证明。
由于这些元件在进化过程中快速变化，跨物种增强子的鉴定就变得复杂了（10）。最近的一项研究表明，鳍和肢体的再生共享进化起源（11）。因此，我们假设，如果驱动再生的遗传机制在受到不同选择压力的远缘物种中是进化保守的，那么应该可以区分物种特异性的和保守的再生应答增强子（RREs）。斑马鱼和非洲鳉鱼Nothobranchius furzeri之间生活史的巨大差异和约2.3亿年的进化距离（图S1A，B）提供了一个独特的生物背景，以测试这一假设。这两个物种在截肢后都能再生出缺失的身体部分。然而，斑马鱼发现于亚洲南部缓慢流动的淡水栖息地，而鳉鱼则栖息于非洲东南部每年干燥的临时性池塘（12）。季节性干燥的强大选择压力促使鳉鱼进化出显著的特征，包括快速的性成熟（短至两周）（13），滞育胚胎（14），以及极短的寿命（4-6个月）（12）。在这里，我们对再生早期阶段的表观遗传和转录变化的系统比较，发现了一个进化上保守的再生程序。我们的证据还表明，在再生能力有限或没有再生能力的脊椎动物物种中，这一程序的元件受到了进化的改变。
硬骨鱼中截肢应答增强子的进化
尽管鳍的形状和生活方式存在巨大差异，鳉鱼和斑马鱼再生尾部组织的早期形态似乎彼此无法区分（图1A；图S1C、D）。截肢线上方存在 E-钙粘蛋白阴性间充质细胞表明，两个物种的尾胚基均在截肢后 1 天 (dpa) 形成（图 1B）。鳉鱼（图 S2）和斑马鱼（15）的胚基细胞在 1 dpa 后迅速增殖和扩张。鉴于驱动特殊再生胚基形成的细胞在这个阶段被招募到伤口部位，我们选择这个时间点进行比较。
活性增强子和启动子的特征是组蛋白 H3K27ac 和 H3K4me3 标记 (16, 17)。我们使用 ChIP-seq 在未受伤 (0 dpa) 和再生尾鳍 (1 dpa) 的样本中分析了鳉鱼和斑马鱼基因组（约 1.5 GB）的 H3K27ac 和 H3K4me3 富集情况。我们的结果揭示了两个物种之间 H3K27ac 标记的假定的 RREs 总数存在显着差异，这些 RREs 与转录起始位点和可用基因模型上的 H3K4me3 峰定义的启动子区域不重叠：1,877 个峰（占检测到的总数的 5%）鳉鱼中的 4,162 个峰 (7%) 和斑马鱼中的 4,162 个峰 (7%)（图 1C、图 S3、表 S1）。全基因组比对揭示了多个鱼类物种中这些假定的 RREs 与基因外显子的序列相比保守性较低（图 S4）。此外，在两个物种中，只有相对一小部分的RREs与具有H3K4me3标记的活性启动子的相同基因组位置相对应（310个基因），而大多数峰仅在一个物种或另一个物种中检测到（图1D和图S5，表S2)。同样，通过RNA-seq在斑马鱼中检测到的再生应答基因（2,829个上调基因和3,363个下调基因）大约是鳉鱼（1,172个上调基因和1,368个下调基因）的两倍（图1E） ，表S3）。检测到的再生应答基因中不到一半是保守的，包括 528 个上调基因和 546 个下调基因（> 1.5 倍或 < -1.5 倍，FDR < 0.01；图 1E-F，表 S3）。两个物种获得了相似的 RNA-seq 比对率和 BUSCO 评分（基因组组装完整性评估）（图 S6），这表明由于基因组组装的质量不同，而观察到的实质性差异不太可能。尽管一些鉴定出的 H3K27ac 峰可能源自未受伤组织和再生组织的细胞类型组成的差异，但我们结果的一致性表明，与斑马鱼相比，对再生的相对不复杂的遗传应答似乎是由鳉鱼鳍截肢引起的。
接下来，我们推断，如果鳉鱼和斑马鱼的再生是由类似的机制驱动的，那么很可能存在由 RREs 激活的进化维持的遗传程序。将 528 个共享上调基因与 310 个共享 RRE 调节基因进行比较，我们鉴定出 49 个基因（P = 1.1e-24，超几何检验）具有 H3K27ac 定义的 RREs、H3K4me3 标记的活性启动子和升高的基因表达（图.1G–H，表 S4)。这个共享队列包含斑马鱼再生的几个已知和重要的调节因子，包括 fgf20a、inhbaa、junbb 和 fn1 (18-21)，以及假定的新型调节因子，如 crlf1、vmp1 和 tgfbr1。对常见 RRE 调节基因 (n=310) 和上调基因 (n=528) 的 GO 分析揭示了分别与细胞迁移/运动相关的top GO term（图 S7A, 图 1D, 表 S5）和细胞分裂/周期（图1I, E，表S5）。对物种特异性基因的类似分析表明，再生过程中不同生物过程存在物种依赖性调节（图S7B-E，表S6）。总而言之，我们的数据不仅揭示了再生早期阶段 RREs激活和基因表达的大规模差异，而且还揭示了处于明显不同选择压力的鱼类中由 RRE 激活的进化保守的再生响应程序（RRP）。
胚基细胞是 RRP 基因表达的主要来源
为了鉴定已识别 RRP 的细胞，我们对早期鳉鱼和斑马鱼再生（分别为 KR 和 ZR）进行了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)。无监督分析发现了鳉鱼中 7,208 个细胞的 13 个簇（KR0 至 KR12）（图 2A，图 S8），以及斑马鱼中 8605 个细胞的 16 个簇（ZR0 至 ZR15）（图 2B，图 S9）。巨噬细胞 (KR0, 1; ZR0, 3, 9, 11)，芽基细胞 (KR2,3,4,5,6,11; ZR 1,2,7,10)，表皮细胞 (KR7,9,10; ZR4,5,6,12,14）和神经元细胞（KR12；ZR13）是已确定的共享细胞类型（图 2C、D），而红细胞（KR8）、中性粒细胞（ZR8）和内皮细胞 (ZR15) 仅在一种物种中检测到，可能是由于丰度较低（图 2D，图 S9K）。胚基细胞簇由已知的胚基标记 msx homeobox gene定义（图 S8F、S9F）(22)。还通过原位杂交鉴定并证实了一种新的早期芽基标记 fstl1（图 2C）。使用四种不同的标记物cyclin A2、mki67、cyclin B1和pcna，我们发现周期细胞主要富集在胚基细胞、表皮细胞和巨噬细胞亚群中（图S10A-D）。此外，所识别的胚基簇可以根据两个 wnt 基因（wnt5a 和 wnt10a）的表达分为两个主要组，两个主要组在两个物种中都有部分重叠（图 S10E-J）。
整合的单细胞分析鉴定了保守的（630个基因）和物种特异性芽基标记基因（例如先前鉴定的斑马鱼lepb基因）（图2E，图S11，表S7）。此外，我们观察到鳉鱼和斑马鱼再生之间基因表达的一些细胞类型差异。例如，补体因子 d (cfd) 在鳉鱼芽基细胞中特异性表达，但 cfd 的表达转移到斑马鱼的表皮细胞中（图 S11C）。与GO富集分析一致（图1I），共享上调基因（n=528）的表达在周期细胞（KR2；ZR1，14）中富集（P < 0.01）（图S12A-B，S13A–B）。在这些基因中，80个基因在胚基群体中特异性表达（图2F）。 49 个 RRP 基因在两个物种的胚基簇（KR2、3、4、5、6、11；ZR1、2、7）和基底表皮细胞（KR10；ZR5）中均表现出显着富集（P < 0.05）（图S12C–D、S13C–D, 图 2G, 图 S14A）。我们的 scRNA-seq 数据支持这样的假设：已鉴定的 RRP 基因主要在再生特异性细胞（即胚细胞）中表达。
再生受限动物中 RRP 失调
接下来，我们研究了 RRP 基因调控的变化是否与其他脊椎动物再生能力的变化相关。我们比较了已发表的 RNA-seq 数据集中针对通过再生（Acomys cahirinus）或疤痕（Mus musculus）对损伤做出反应的小鼠物种的 RRP 基因表达 (23, 24)。在 A. cahirinus 的耳廓再生过程中，49 个硬骨鱼定义的 RRP 基因中有 20 个显着上调（> 1.5 倍，FDR < 0.01）（图 S14B，C）。相反，它们在非再生耳廓中的表达失调（图2H，图S14B，C，表S8）。例如，crlf1、itga4 和 tha1 在 A. cahirinus 再生过程中显着上调，但在 M. musculus 中疤痕形成过程中没有显着上调。此外，TGF-β配体inhba（即激活素A或激活素）在M. musculus的疤痕形成过程中被高度且持续地激活，但仅在A. cahirinus的再生早期阶段上调（图2H, S14B，C）。这与小鼠皮肤中 inhba 的过度表达可加速伤口愈合但促进疤痕形成的报道一致 (25, 26)。同样，在皮肤再生和疤痕形成之间也观察到了 RRP 基因的失调（图 S14D-F，表 S8）。在疤痕形成过程中某些 RRP 基因的激活失败或改变表明，硬骨鱼定义的 RRP 可能在有再生能力和无再生能力的动物中经历了进化变化。
RRE K-IEN 指导截肢后基因激活，对于再生至关重要
为了测试所鉴定的增强子是否在再生中发挥作用，我们验证了 ChIP 鉴定的 5 个在鳉鱼中调节 inhba(2of2)、fgf20(2of2)、junb(1of2)、vmp1 和 mbd2 的 RREs（图 3 A,B, 图S15；图1H)。我们关注基因inhba，因为它是斑马鱼尾部和心脏再生所必需的(19, 27)，并且在再生组织和非再生组织之间受到差异性调节(图2H)。鳉鱼基因组中存在两个 inhba 拷贝，但只有 inhba(2of2) 对截肢有反应（图 S16A）。为了表征鳉鱼 inhba(2of2) 增强子，我们将基因启动子上游 H3K27ac 峰标记的 1,159 bp DNA 序列（称为 K1159）克隆到带有 GFP 报告基因的转基因载体中，并产生了稳定的转基因鳉鱼（图.3C)。在 K1159:GFP 转基因鱼中截肢后，在芽基区检测到了强大的报告基因表达（图 S16B）。同样，我们还观察到四个额外增强子的截肢激活 GFP 表达（图 S15），强烈支持我们识别再生激活增强子的方法的有效性。
通过生成具有不同截断的四个附加构建体（图 3C），我们鉴定了鳉鱼 inhba(2of2) 增强子 (K-IEN) 的最小序列，它概括了原始 K1159:GFP 表达和内源 inhba(2of2) 表达（图 3A、D；图 S16C)。我们发现并非所有类型的损伤都会类似地激活已识别的增强子。与仅去除层间组织相比，当损伤涉及多个组织（例如骨和层间组织）的再生时，观察到最强烈的反应，并且在进行无组织损失的小切口后检测到的表达明显较差（图3E） 。我们还观察到，与远端截肢相比，近端截肢的反应更强（图 3F）。我们从这些数据中得出结论，K-IEN 指导基因表达以响应不同类型的损伤和位置。
由于 inhba 在斑马鱼心脏再生过程中被激活且需要 (27)，因此我们接下来询问 K-IEN 是否也在鳉鱼心脏中表现出增强子活性。与斑马鱼心脏再生相似 (28)，我们在损伤后 7 天 (dpi) 观察到轻微的纤维化疤痕，并通过 AFOG 染色在 18 dpi 时观察到疤痕消退（图 4A-C）。此外，鳉鱼心肌细胞保持了损伤应答而增殖的能力（图4D）。这些结果证实鳉鱼心脏具有再生能力。在切除K-IEN:GFP鳉鱼的心脏时，我们观察到再生的心脏组织中有强大的GFP激活，这还没有形成完全分化的心肌纤维，因为缺乏分化的心肌标志物tropomyosin（图 4E）。相比之下，未损伤区域（tropomyosin阳性）没有可检测到的 GFP 表达。此外，在 K-IEN:GFP 鳉鱼发育中的鳍和心脏中未检测到 GFP 的表达（图 S16D-F）。我们从这些数据中得出结论，与尾鳍再生一样，K-IEN 的激活在心脏中是再生依赖性的。
为了确定再生是否需要 K-IEN，我们使用 CRISPR/Cas9 方法设计了两种 gRNA 以靶向鳉鱼中的 K-IEN（图 4F）。与野生型动物相比，K-IEN 的破坏显着延迟了纯合突变体的尾部再生（图 4 G，图 S17A，B）。此外，心脏再生也受到显着损害，导致损伤部位的疤痕消退失败（图4H；图S17C、D）。然而，突变体中心肌细胞增殖并未受到影响（图 4I）。总而言之，我们的数据表明 K-IEN 是一种具有多效性功能的 RRE，是鳉鱼组织再生所必需的。
检测脊椎动物中一个重要的RRE进化上的变化
为了研究具有基本再生作用的RRE是否可以进化，我们试图用mVISTA（29）来确定K-IEN在不同脊椎动物中的同源序列。多重序列比对发现在鳉鱼、斑马鱼和人类的infba位点附近有一个相对保守的非编码区（图5A）。预测的斑马鱼序列和H3K27ac标记的区域之间的重叠表明，预测的增强子可能是生物相关的。我们克隆了含有预测的斑马鱼和人类元素的DNA片段，并为每个元件在鳉鱼中生成了稳定的转基因报告系。zebrafish inhba enhancer（Z-IEN）驱动再生依赖的GFP表达，其方式与K-IEN无异（图5B，,C）。相比之下，由预测的human inhba enhancer（H-IEN）引导的GFP表达在2dpa前几乎检测不到，但在3dpa时被有力地观察到并持续到5dpa（图5D，图S16B）。与K-IEN:GFP和Z-IEN:GFP不同，H-IEN:GFP的表达仅限于基底表皮细胞，而不是间质细胞（图5D），让人联想到人类和小鼠皮肤在受伤时的infba激活（26，30）。我们还观察到，在鳉鱼心脏再生过程中，Z-IEN:GFP的表达有截肢依赖性的激活，但H-IEN:GFP则没有（图5E）。相反，H-IEN在心内膜细胞和一些心外膜细胞中指导GFP的表达（图5F）。
通过重新表达由Z-IEN驱动的killifish inhba，而不是H-IEN，能够拯救K-IEN-/-突变体的鳍再生表型，这意味着增强子的功能变化（图S18）。这些结果表明，一个祖先的、进化上保守的、在再生中具有不可或缺的作用的硬骨鱼的RRE已经使其功能多样化，这意味着RRE的进化周转是脊椎动物再生能力变化的一个潜在机制。
AP-1 motifs的基因组占有率对RRE活动至关重要
为了研究是什么决定了鉴定的RREs中的损伤应答，我们对保守和物种特异性元件进行了motif富集分析。我们发现，一个共识的12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate responsive element（TRE），TGA[G/C]TCA被AP-1转录因子复合物识别，是所有分析中最富集的motif（图6A-B；图S19A-C）。同样，AP-1motifs也富集在参与果蝇imaginal disc再生和acoel worms再生的开放染色质区域（图S19D，E）（31，32）。AP-1复合物是一个异质二聚体，由不同的DNA结合蛋白家族的成员组成，包括Jun、Fos、ATF、JDP和Maf家族（33）。AP-1同时结合TRE和cAMP反应元件（CRE，TGACGTCA）（34）。在鳉鱼（图S20A-E）和斑马鱼（图S21）的囊肿形成scRNA-seq中均检测到AP-1成分的细胞类型偏向表达，表明不同的细胞群可能形成不同的AP-1复合体。此外，对不同物种之间的AP-1motifs进行全基因组预测显示，由Jun家族蛋白（Jun、JunB和JunD）识别的CRE motifs在再生能力强的鱼类基因组中存在的频率远远高于人类和小鼠基因组（图S22）。综上所述，这些结果确定了AP-1结合位点是本研究中确定的所有RREs的共同特征，并揭示了再生能力强的动物和无法再生的动物之间预测的AP-1结合motifs的频率差异。
为了确定AP-1 motifs是否对RREs的活性至关重要，我们在K-IEN（GCTGACTCAGA和GCTGACTCACTG）和Z-IEN（GCTGACTCAT和GCTGACTCTA）中确定了预测的AP-1结合点，并对它们进行了定点诱变（图6C）。所有的图案被突变为GCAAAAAAA或GCAAAAAAAA（图6C-E）。稳定的转基因报告实验显示，与原来的增强子相比，由K-IENM12-或Z-IENM12-突变的增强子驱动的GFP表达完全被取消了（图6C-E）。此外，通过JNK途径抑制剂SP600125阻断AP-1复合物的激活，削弱了K-IEN的活性，并抑制了尾巴再生（图S20F和G）。我们的结论是，AP-1图案是响应截肢而激活RREs的必要条件。
讨论
基因的激活或失活被怀疑是再生能力变化的基础，然而这些基因活动是如何被调控的仍然知之甚少。AP-1转录因子对许多生物过程至关重要，它们的不同功能是信号通路复杂动态网络的一部分，已知取决于亚单位的组成和与其他核因子的相互作用，而这又部分取决于细胞类型和细胞环境（33）。在本研究中，AP-1成分并非在所有细胞类型中都普遍表达，而是在间质和上皮细胞中都存在，这表明可能需要特定的亚单位组成来限制增强子在间质（K-IEN，Z-IEN）或上皮细胞（H-IEN）的表达。此外，人类增强子中存在一个预测的p53/p63结合 motif，而在K-IEN和Z-IEN中却没有（图S23A），而且p63在基底表皮细胞中表达丰富（图S23B），这表明AP-1与其他核因子的相互作用也可能在调节增强子活性方面起作用。
鉴于AP-1复合体的古老进化起源（35，36），我们假设富含AP-1特征的增强子的祖先功能是激活再生反应，通过进化和物种形成的过程，再生和损伤反应在一些但不是所有增强子中变得相互分离（图6F）。重新利用祖先的调控序列来产生新的调控功能并非没有先例（37），而且在脊椎动物（38）和无脊椎动物（39）中都有很好的记载。例如，小鼠和人类基因组中的DNase I–hypersensitive sites揭示了频繁的调控元件再利用（40）。这些研究表明，同源基因组中的调控元件在不同的组织中具有功能活性，表明顺式调控的可塑性可能是脊椎动物进化的一个关键促进因素（40）。未来的实验旨在确定与进化保守的RRE和物种特异性损伤应答增强子相关的AP-1复合体的体内组成，这不仅有助于确定增强子再利用的基础机制，而且还可能有助于解决长期存在的问题，即为什么有些物种在截肢后能再生出缺失的身体部位，而其他物种却不能。
[原文]
Wei Wang et al. ,Changes in regeneration-responsive enhancers shape regenerative capacities in vertebrates.Science369,eaaz3090(2020).DOI:10.1126/science.aaz3090
