第二代DNA测序技术
大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程:
- 文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。
- 簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。
- 测序，分三步：DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。
- 数据分析。
RNA-Seq
RNA-Seq，即RNA测序又称转录组测序,是基于第二代测序技术的转录组学研究方法：首先提取生物样品的全部转录的RNA，然后反转录为c-DNA后进行的二代高通量测序，在此基础上进行片段的重叠组装，从而可得到一个个的转录本。进而可以形成对该生物样品当前发育状态的基因表达状况的全局了解（globle）。进一步说，若和下一阶段的生物样品的RNA-Seq转录组进行比较，则可以得到全部的（在转录层面）基因表达的上调及下调--这就形成了表达谱，针对关键基因则可以形成你要想要的pathway的构建。
RNA-seq能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测, 在分析转录本的结构和表达水平的同时, 还能发现未知转录本和稀有转录本, 精确地识别可变剪切位点以及cSNP(编码序列单核苷酸多态性), 提供更为全面的转录组信息。该技术首先将细胞中的所有转录产物反转录为 cDNA 文库(利用最新的SMS技术可略去这一步, 直接对RNA进行测序), 然后将cDNA 文库中的 DNA 随机剪切为小片段(或先将RNA片段化后再反转录), 在cDNA两端加上接头利用新一代高通量测序仪测序, 直到获得足够的序列, 所得序列通过比对(有参考基因组)或从头组装(de novo assem- bling)(无参考基因组)形成全基因组范围的转录谱。
RNA-Seq技术具有诸多独特优势:
- 数字化信号
- 高灵敏度
- 任意物种的全基因组分析
- 更广的检测范围
具体请查找相关文献
参考资料：
- 一代、二代、三代测序技术
- 维基百科
- 祁云霞, 刘永斌, 荣威恒. 转录组研究新技术 ：RNA-Seq 及其应用[J]. 遗传, 2011(11)
