小RNA预测前面步骤

准备文件及软件

ViennaRNA-2.4.17（重要）

ncbi-blast-2.9.0+

bowtie

miRDP2-v1.1.4_pipeline.bash（重要）

程序大致流程

1.fq文件转化成fa文件（利用两个perl脚本）

01-run_fq2fa.sh && fq2fa.pl
perl fq2fa.pl 201_FRRN202416676-1a_clean.fq 201_FRRN202416676-1a.fa
perl fq2fa.pl 202_FRRN202416677-1a_clean.fq 202_FRRN202416677-1a.fa
perl fq2fa.pl 203_FRRN202416678-1a_clean.fq 203_FRRN202416678-1a.fa
perl fq2fa.pl 211_FRRN202416700-1a_clean.fq 211_FRRN202416700-1a.fa
perl fq2fa.pl 212_FRRN202416701-1a_clean.fq 212_FRRN202416701-1a.fa
perl fq2fa.pl 213_FRRN202416702-1a_clean.fq 213_FRRN202416702-1a.fa
perl fq2fa.pl 281_FRRN202416688-1a_clean.fq 281_FRRN202416688-1a.fa
perl fq2fa.pl 282_FRRN202416689-1a_clean.fq 282_FRRN202416689-1a.fa
perl fq2fa.pl 283_FRRN202416690-1a_clean.fq 283_FRRN202416690-1a.fa
perl fq2fa.pl 402_FRRN202416679-1a_clean.fq 402_FRRN202416679-1a.fa
perl fq2fa.pl 403_FRRN202416680-1a_clean.fq 403_FRRN202416680-1a.fa
perl fq2fa.pl 404_FRRN202416681-1a_clean.fq 404_FRRN202416681-1a.fa
perl fq2fa.pl 481_FRRN202416691-1a_clean.fq 481_FRRN202416691-1a.fa
perl fq2fa.pl 482_FRRN202416692-1a_clean.fq 482_FRRN202416692-1a.fa
perl fq2fa.pl 483_FRRN202416693-1a_clean.fq 483_FRRN202416693-1a.fa
perl fq2fa.pl 601_FRRN202416682-1a_clean.fq 601_FRRN202416682-1a.fa
perl fq2fa.pl 603_FRRN202416683-1a_clean.fq 603_FRRN202416683-1a.fa
perl fq2fa.pl 604_FRRN202416684-1a_clean.fq 604_FRRN202416684-1a.fa
perl fq2fa.pl 681_FRRN202416694-1a_clean.fq 681_FRRN202416694-1a.fa
perl fq2fa.pl 682_FRRN202416695-1a_clean.fq 682_FRRN202416695-1a.fa
perl fq2fa.pl 683_FRRN202416696-1a_clean.fq 683_FRRN202416696-1a.fa
perl fq2fa.pl 801_FRRN202416685-1a_clean.fq 801_FRRN202416685-1a.fa
perl fq2fa.pl 802_FRRN202416686-1a_clean.fq 802_FRRN202416686-1a.fa
perl fq2fa.pl 803_FRRN202416687-1a_clean.fq 803_FRRN202416687-1a.fa
perl fq2fa.pl 811_FRRN202416703-1a_clean.fq 811_FRRN202416703-1a.fa
perl fq2fa.pl 812_FRRN202416704-1a_clean.fq 812_FRRN202416704-1a.fa
perl fq2fa.pl 813_FRRN202416705-1a_clean.fq 813_FRRN202416705-1a.fa
perl fq2fa.pl 881_FRRN202416697-1a_clean.fq 881_FRRN202416697-1a.fa
perl fq2fa.pl 882_FRRN202416698-1a_clean.fq 882_FRRN202416698-1a.fa
perl fq2fa.pl 883_FRRN202416699-1a_clean.fq 883_FRRN202416699-1a.fa
#! /usr/bin/perl -w
use strict;
use warnings;

if(@ARGV!=2)
{
        print "\nperl $0 <fq> <output>\n";
        exit;
}

open OUT,">$ARGV[1]";
if($ARGV[0]=~/\.gz$/)
{
        open IN,"gzip -dc $ARGV[0] | " || die "Cannot open the file '$ARGV[0]'.\n";
}
else
{
        open IN,"$ARGV[0]" || die "Cannot open the file '$ARGV[0]'.\n";
}
while(<IN>)
{
        chomp;
        if($_=~/^\@/)
        {
                my $line=$_;
                $line=~s/^\@//;
                my $seq=<IN>;
                chomp $seq;
                <IN>;
                <IN>;
                print OUT "\>$line\n$seq\n";
        }
}
close IN

得到结果fa文件
顺便利用脚本进行 collapse 一下除去冗余序列
perl collapse_reads_md.pl 201_FRRN210045013-1a_clean.fa 201 > 201_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 202_FRRN210045014-1a_clean.fa 202 > 202_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 203_FRRN210045015-1a_clean.fa 203 > 203_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 211_FRRN210045019-1a_clean.fa 211 > 211_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 212_FRRN210045020-1a_clean.fa 212 > 212_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 213_FRRN210045021-1a_clean.fa 213 > 213_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 281_FRRN210045016-1a_clean.fa 281 > 281_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 282_FRRN210045017-1a_clean.fa 282 > 282_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 283_FRRN210045018-1a_clean.fa 283 > 283_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 801_FRRN210045022-1a_clean.fa 801 > 801_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 802_FRRN210045023-1a_clean.fa 802 > 802_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 803_FRRN210045024-1a_clean.fa 803 > 803_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 811_FRRN210045028-1a_clean.fa 811 > 811_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 812_FRRN210045029-1a_clean.fa 812 > 812_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 813_FRRN210045030-1a_clean.fa 813 > 813_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 881_FRRN210045025-1a_clean.fa 881 > 881_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 882_FRRN210045026-1a_clean.fa 882 > 882_collapsed.fa
perl collapse_reads_md.pl 883_FRRN210045027-1a_clean.fa 883 > 883_collapsed.fa

2.过滤数据库rfam里面存在的snRNA，tRNA，rRNA（先建库，再blast-short比对）。

进入rfam官网下载已经注释过的小RNA序列进行过滤(自行准备构建数据库的TXT文件)

linux 中Rfam文件夹

需要首先构建需要的数据库

#!/bin/bash
trna_no=`awk '{print $1}' rfam.anno.tRNA.txt|sed 's/$/&\.fa/g'`
cat $trna_no|sed -n '/Brassica rapa/{p;n;p}' > rfam.Br.trna.fa
snrna_no=`awk '{print $1}' rfam.anno.snRNA.txt|sed 's/$/&\.fa/g'`
cat $snrna_no|sed -n '/Brassica rapa/{p;n;p}' > rfam.Br.snrna.fa
rrna_no=`awk '{print $1}' rfam.anno.rRNA.txt|sed 's/$/&\.fa/g'`
cat $rrna_no|sed -n '/Brassica rapa/{p;n;p}' > rfam.Br.rrna.fa

利用数据库进行blast筛选

#!/bin/bash
cd /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/all_fa/collapsed/
all_collapsed=`ls *.fa`
cd /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/blastresult
for each in $all_collapsed
        do
        mkdir /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/blastresult/${each%_collapsed.fa}_blast_result
        cd /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/blastresult/${each%_collapsed.fa}_blast_result
        blastn -task blastn-short -query /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/all_fa/collapsed/$each -out ${each%.fa}_trna.blast -db /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/database/rfam.Br.trna.fa -outfmt 6 -evalue 0.01 -num_threads 15 > trna.log 2>&1
        blastn -task blastn-short -query /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/all_fa/collapsed/$each -out ${each%.fa}_rrna.blast -db /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/database/rfam.Br.rrna.fa -outfmt 6 -evalue 0.01 -num_threads 15 > rrna.log 2>&1
        blastn -task blastn-short -query /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/all_fa/collapsed/$each -out ${each%.fa}_snrna.blast -db /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/database/rfam.Br.snrna.fa -outfmt 6 -evalue 0.01 -num_threads 15 > snrna.log 2>&1
        echo "blastn on $each against rfam trna/rna/snrna/ completed."
        cat *.blast | awk '{print $1}' | sort | uniq > annotated.txt
        sed -n '/^>/p' /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/all_fa/collapsed/$each | sed 's/^>//g' | sort >  all_seq.txt
        sort all_seq.txt annotated.txt annotated.txt | uniq -u > unannotated.txt
        perl /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/script/find_seq.pl /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/all_fa/collapsed/$each unannotated.txt ../${each%.fa}_rfam_filtered.fa
done

脚本及得到结果展示

drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:07 202_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 61105346 Aug 27 11:07 202_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:08 203_blast_result(文件夹)
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 44977522 Aug 27 11:08 203_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:08 211_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 74839342 Aug 27 11:08 211_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:09 212_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 73569078 Aug 27 11:09 212_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:09 213_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 38660943 Aug 27 11:09 213_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:10 281_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 27353974 Aug 27 11:10 281_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:10 282_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz  2577866 Aug 27 11:10 282_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:11 283_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 45590628 Aug 27 11:11 283_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:11 801_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 80959125 Aug 27 11:11 801_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:12 802_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 70634094 Aug 27 11:12 802_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:12 803_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 73491769 Aug 27 11:13 803_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:13 811_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 99104952 Aug 27 11:13 811_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:14 812_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 72978623 Aug 27 11:14 812_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:14 813_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 85759911 Aug 27 11:15 813_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:15 881_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 25394610 Aug 27 11:15 881_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:15 882_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 36754402 Aug 27 11:16 882_collapsed_rfam_filtered.fa
drwxrwxr-x 2 zhaorz zhaorz     4096 Aug 27 11:16 883_blast_result
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 59156802 Aug 27 11:16 883_collapsed_rfam_filtered.fa
文件处理脚本

3.bowtie过滤比对上的结果

#!/bin/bash
cd /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/blastresult
for each in `ls *.fa`
do
        cd /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/exon_filter
        bowtie -S -f -a -v 1 --best --strata -m 20 -p 10 --al ${each%.fa}_for_exon.fa --un ${each%.fa}_no_exom.fa /40t_1/zhaorz/Brapa/new_gff_cds_v1.5.fa /40t_1/zhaorz/Brap_mRNA_miRNA/2.miRNA_analysis/1.sRNAanno/blastresult/$each ${each%.fa}_exon_alignment.sam
        rm ${each%.fa}_exon_alignment.sam
done

4.对最终没有比对上的fa进行预测

-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 45580592 Aug 27 11:27 201_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 50716287 Aug 27 11:28 202_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 34495664 Aug 27 11:28 203_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 61030605 Aug 27 11:28 211_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 63974638 Aug 27 11:28 212_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 32602771 Aug 27 11:28 213_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 22284478 Aug 27 11:28 281_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz  2206115 Aug 27 11:28 282_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 38551549 Aug 27 11:28 283_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 70757578 Aug 27 11:28 801_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 62661095 Aug 27 11:28 802_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 63474741 Aug 27 11:28 803_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 87078561 Aug 27 11:28 811_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 66189962 Aug 27 11:28 812_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 73387062 Aug 27 11:28 813_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 22931447 Aug 27 11:28 881_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 32011463 Aug 27 11:29 882_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa
-rw-rw-r-- 1 zhaorz zhaorz 51799744 Aug 27 11:29 883_collapsed_rfam_filtered_no_exom.fa

利用 cat *fa > final_fa（不确定可行性）
得到一个fa文件进行下一步的预测

nohup miRDP2-v1.1.4_pipeline.bash -g /40t_1/zhaorz/Brapa/Brapa_sequence_v1.5.fa -x /40t_1/zhaorz/Brapa/bt_v1.5_index/Brapa_sequence_v1.5.fa -p 10 -f -i final_fa  -o . &

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小RNA预测前面步骤

准备文件及软件

程序大致流程

1.fq文件转化成fa文件（利用两个perl脚本）

2.过滤数据库rfam里面存在的snRNA，tRNA，rRNA（先建库，再blast-short比对）。

3.bowtie过滤比对上的结果

4.对最终没有比对上的fa进行预测

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