表观转录组学：再探RNA

   为了找到新的思路，科学家们有时会查阅几十年前发表的研究报告。这就是Wendy Gilbert最近在RNA修饰研究中所做的。转运RNA（tRNAs）和信使RNA（mRNAs）富含腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶的150多种修饰变体。假尿苷在rRNA和tRNA中含量丰富，但是当Gilbert在2013年开始她的研究时，没有人知道这种修饰是否存在于mRNA中。

   身为耶鲁大学副教授的Gilbert，转而查阅新泽西州罗氏研究中心（Roche Research Cente）的生物化学研究人员于1993年发表的一项研究。在这项研究中，Andrey Bakin和James Ofengand给RNA中的假尿苷添加了一个庞大的化学基团。他们发现，这种超大型的假尿苷阻碍了逆转录酶介导RNA模板生成互补DNA（cDNA）的作用，阻碍了逆转录酶的运行。

   Gilbert和她的同事随后将该方法应用于酵母细胞和人类细胞，采用新一代测序技术（NGS）来检测产生的cDNAs。他们在基因组中几百个人类基因的转录本上检测到由假尿苷引起的过早截短的cDNA信号。而在其他几个课题组的实验中，也同时出现了假尿苷的mRNA图谱。这种修饰的出现并不仅仅是一种偶然，它在mRNA上存在的水平随着细胞压力的变化而发生变化，这表明它具有调节作用。

   像Gilbert这样的研究是在全基因组水平上研究修饰相关论文潮流的一部分。除了涉及假尿苷的修饰外，其他一些修饰也得到了特别关注，尤其是N6-甲基腺苷（m6A），它在发育和疾病过程中对mRNA的调控起着关键作用。应用于mRNA和长非编码RNA研究的方法是新的，还有许多方法仍在理论测试阶段，并需要反复试错来加以验证。

   这些新方法也推动了新兴的表观转录组学领域的发展，表观转录组学这是一个定义松散的术语，它包括RNA修饰及其相关调节因子的生物学。“在未来，你不会认为任何RNA分子仅仅是一种具有某种二级结构的信息载体分子，”Christopher Mason如是说，他是纽约市威尔康奈尔医学院的助理教授。“你会从如何修改、如何调控、如何包装以及如何控制等方面来考虑它们。”

转向mRNA修饰

   与mRNAs相比，tRNA和rRNA修饰的检测研究是较为成熟的领域。毕竟，这些非编码RNA比mRNA含量更丰富，易于生化研究。尤其是tRNA可以进行质谱分析，它的体积小到足以让研究人员将修饰的化学成分和它在序列中的位置一起鉴定出来。此外，许多研究者认为研究mRNA是一个更令人生畏的挑战，因为它能改变细胞中那些巨大甚至稀有的功能分子。

   到目前为止，对mRNA的修饰研究屈指可数。而其中一些备受争议：研究人员争论的焦点是它们的普遍性，它们的生物学相关性，以及“判定”修饰位点的分析是否足够严格。

   随着现有技术的改进和新技术的发明，该领域的一些开放性问题将得到解决。在用来发现新的修饰和探测现有修饰的方法中，利用一些最成熟的抗体可以亲和纯化含有修饰的RNA。

   2012年完成的一项研究通过使用抗体亲和纯化法，绘制了m6A的修饰谱图，人们普遍认为这项研究开辟了一个新的领域。在2012年之前，有证据表明m6A可能在mRNA调控中起关键作用。在许多真核生物中都发现了它，例如在酵母产孢以及拟南芥组织分裂的过程中，它在mRNA上的修饰水平升高。

   随着NGS方法的出现，两个研究小组对此进行了更深入的研究。一个是由Gideon Rechavi领导的舍巴医疗中心，它隶属于以色列特拉维夫大学；另一个团队包括Mason和Samie Jaffrey。Samie Jaffrey是威尔康奈尔医学院的药理学教授，也是一家总部位于纽约的生物科技公司Gotham Therapeutics的共同创办人。

   两个研究团队均使用m6A抗体亲和纯化含有该修饰的RNA片段。然后他们利用这些片段创建了cDNA文库并对其进行了测序，生成了一张潜在的m6A位点图。他们利用被称为meRIP-Seq和m6A-seq的方法发现了数以千计的修饰。例如，Rechavi’s的小组在7000多个人类基因的转录本中发现了超过12000个m6A修饰位点。m6A同样存在于哺乳动物的长非编码RNA中。

   研究者们已经确定了与m6A相互作用的专用酶：“书写者”负责将修饰添加到mRNA上，“阅读者”负责实现其功能，而“擦除者”则负责移除这些修饰。他们已经证明了m6A通常是在应答刺激时调节mRNA的翻译、稳定性和剪接。在拟南芥中，m6A可以稳定那些参与盐和渗透胁迫反应应答的转录本。在哺乳动物中，它似乎在学习和记忆、血细胞生成和X染色体失活等方面起作用。

   这些发现反映了进化史上可能有一个时期，那时RNA可能作为一个中心分子，一些生物学家称之为“RNA世界”。Rechavi说，“我确信，这将是基因表达调控的重要层面。”

“可成药的领域”

   这些发现也有可能对现实世界产生影响。“我们可以看到实际影响的初步成果，” Rechavi说，他指出，有几项研究已经将m6A修饰与癌症联系起来。例如，Tony Kouzaride和他的同事在英国剑桥大学格登研究所最近的一项研究表明，m6A的书写者——METTL3（甲基转移酶样蛋白3）促进了急性髓系白血病细胞的生长。尽管大多数人对它们的存在保持沉默，但几家生物技术初创公司正在进军这一领域。

   Kouzarides说：“这是一个有可能成药的领域，而且其中有很好的靶点。”他也是英国剑桥Storm Therapeutics生物技术公司的共同创始人之一，该公司主要根据Kouzarides实验室的研究结果开发产品。位于马萨诸塞州剑桥市的Twentyeight-Seven Therapeutics公司，主要专注于RNA研究，其创始人Richard Gregory解释说，像METTL3这样的潜在靶点在结构上与DNA甲基化酶相似，而DNA甲基化酶正是现有癌症药物的靶点。Accent Therapeutics公司则位于马萨诸塞州列克星敦市，其科学联合创始人Chuan He表示，该公司正在对几种RNA修饰蛋白开展研究。

   同时，研究人员采用meRIP-Seq/m6A-seq方法去检测其他修饰，例如N1-甲基腺苷（m1A）以及最近发现的N4-乙酰胞苷（ac4C）。他们正在开发基于抗体的新一代技术，如Jaffrey和同事开发的miCLIP，用于检测m6A。该方法主要通过将抗体交联到RNA修饰上，产生逆转录酶的阻断和cDNA的截短。与meRIP-Seq/m6A-seq生成的100-200个碱基对读取相比，该方法更精确地确定了修饰的位置。

   Rechavi提示道，要使这种方法达到最优效果，一是要将经验证的抗体很好的粘附在预期靶标上，二是尽量减少脱靶的结合。但在一个新方法和数据不断受到挑战的领域，这只是其中一个问题。

数据的分歧

   在过去的几年里，m6A和假尿苷的全转录组谱图已经产生，随着综合数据集变得越来越可靠，评估数据集质量的研究正在兴起。但是最近研究的一些修饰数据如m1A和2'-邻甲基（Nm）-仍然是备受争议。

   这个领域的大多数方法都“适合于在数字较低的一端发现一些共同之处，随后意见就会出现分歧”，德国美因茨大学药物化学研究院副教授Mark Helm说。

   当“对什么是信号与什么不是信号的解释有很大不同”时，就会产生争议，海德堡的德国癌症研究中心教授Michaela Frye补充道，他同时是Storm Therapeutics公司的一位顾问。

   有几篇综述已经解决了这样的争议，包括Helm、Jaffrey和其他人合著的论文。这些综述概述了建立实验质控的方法，使用正交法验证结果，并确保更严格的数据分析。研究人员还呼吁，进行更多的实验来验证RNA修饰位点是否是具有生物学功能的真实位点。例如，通过敲除或使用伊利诺伊州芝加哥大学Tao Pan小组开发的技术——SCARLET。SCARLET可以生化检测和量化特定转录本中任何核苷酸的修饰残基。然而，Gilbert说，这样的验证“几乎从未完成过”。

   但是，尽管任何新兴领域都有这种反复，但有一个共识是需要新的实验方法。

旧的变成新的

   芝加哥大学的化学教授何川的研究目标是，开发新的既可以定量又便于使用的表观转录组方法。为了迎接这一挑战，他获得了国家人类基因组研究所为期五年、价值1060万美元的资助。“该领域的主要需求是新技术”他说。

   研究人员最终希望找到一种方法，能够精确地说明基因修饰在基因组上的位置，同时也能量化mRNAs和非编码RNAs中该修饰所占比例。具有这种潜力的方法包括对单个RNAs进行测序的新兴技术，例如纳米孔测序，即用电流将RNA分子穿过膜上的一个小孔，然后通过测量电流的变化来读取序列。

   由西班牙巴塞罗那基因组调控中心的Mason 和Eva Maria Novoa组成的团队，在BioRxiv上发表的一项新的研究，令人感兴趣的是，用纳米孔测序检测m6A的准确率为90%。

   一些研究人员乐观地认为，纳米孔技术将大大提高精确度，但其他研究人员则持迟疑态度。“我喜欢这种方法，因为我认为它可以解决所有问题，”Frye说，但她指出，检测极为罕见的修饰是一个挑战，即使使用的方法只是稍稍有点不准确。

   其他更远期的方法包括改进质谱方法以应用于mRNA检测，或提升成像技术，这些技术改良目前仍处于起步阶段，Sara Rouhanifard说。她是在波士顿麻省理工学院生物工程专业的助理教授。

   何川的课题组目前正在研究与二代测序或其他测序方法相串联的技术。“希望在两年内，人们可以从一家公司购买一套包含‘多种方法’的试剂盒”，他说，“然后使用他们可以下载的软件，做自己想做的任何事。”例如，他的小组就应用定向进化的方法来产生逆转录酶，将碱基改变引入cDNA，以检测不同的RNA修饰。

   与此同时，Gilbert仍在回看历史。她说，并非只有她一个人在审视旧的研究成果，她想看看能用什么样的方法“转变成下一代测序分析技术，这将有助于找到新的修饰。”她还渴望探索RNA结合蛋白如何调节和阐释假尿苷传递的信息，它似乎没有专门的mRNA 阅读者或者书写者，她补充道。

当前和未来的工具

   越来越多的研究人员开始对表观转录组技术表现出兴趣，尤其是对m6A修饰。

   已经有一些试剂盒可以用于meRIP-Seq/m6A-seq方法（例如，来自新英格兰生物实验室）。Jaffrey使用的是来自Abcam和Synaptic Systems的抗体。Jaffrey补充说，其他技术，比如miCLIP，需要更多的技巧，他已经发布了miCLIP和meRIP Seq的详细实验方案。

   以色列雷霍沃特的魏茨曼科学研究所的RNA研究人员Schraga Schwartz指出深入研究数据需要计算生物学方面的专业知识，尽管他相信随着工具的发展，数据将变得更容易解释。对m6A感兴趣的研究人员，可以“大致了解数据是什么样子的”，他说，但在不同条件下获得可以定量比较的数据“要复杂得多”。

   Mason鼓励研究人员将他们的技能拓展到表观转录组研究中来，“在生物学中，很少有这样一个广阔的领域等待被探索。在这种情况下，出现的问题是‘我的RNA修饰会影响我的某部分生物学功能吗？’到目前为止，答案似乎总是‘是的’。”他说，“我认为掌握这套技能的好处是，你可以很快点亮一道新的光线，从某个角度照亮你长期以来所关注的生物学问题，然后以新的方式看待它。”■

（译者李楠是中国科学院深圳先进技术研究院的副研究员）