Single-Cell ATAC-Seq的初步了解

这一篇笔记是有关于单细胞ATAC-seq的初步了解。在阅读相关文献之前,我还是在网上找了些视频来看,想先对其有一个整体上的认识。这里有一个比较好的视频,讲的很浅显易懂。供大家参考:Understanding Single-Cell ATAC-Seq and its Applications

首先来复习一下什么是ATAC-seq?全称:Assay for Transposase Accessible Chromotin。用来研究基因组的可接近性。是利用tn5转座酶来实验的。首先是从500-10k的细胞里提取DNA,把它们与Tn5(接有接头的)一起孵育。Tn5会靶向那些容易接近的染色质区域,然后进行切割,并把接头接到上面。之后把这些DNA片段进行纯化,并进行PCR扩增。之后测序。

那么ATAC-seq可以帮我们解决什么问题呢?比如说:
(1)可以快速的鉴定出epigenetics是否对你的处理产生了应答。如果你没有组蛋白修饰的candidates,或者你也不知道哪些转录因子起调控作用,你就应该首先考虑先拿到epigenetics landscape。
(2)根据开放的染色质区域,可以推断出哪些染色质修饰是我们感兴趣的。
(3)根据开放的染色质区域,可以预测哪些转录因子可能结合在这些区域,从而调控细胞“命运”、疾病以及对药物的应答。
(4)预测潜在的pathway调节机制。

上面讲了ATAC-seq可以为我们解决的问题。但是它仍然有一些局限性:
(1)ATAC-seq的输出的数值是样品里所有细胞的平均值。比如上图展示了一段染色质在CD33基因附近的开放情况。你从这个图上没有办法区分是哪一群细胞诱导了这种应答。
(2)如果你想要研究的细胞群在整个样品里只占一很小部分,那么你在使用流式对其分选的过程也是非常的耗时,并且会引入一些操作上的影响。
所以你的目的细胞是一群很rare的细胞群,那么scATAC-seq会帮你解决上面这个问题。

什么是scATAC-seq?它的原理和标准的ATAC-seq的方法一样,也是利用Tn5转座酶来实现的。只不过结合了barcode来对每一个细胞进行标记,这样就可以从单细胞水平来看染色质的开放情况了。目前主要有两种平台,一是结合细胞index的技术;另一种是基于液滴技术。

对于细胞indexing方法:同样你需要先分离细胞,把细胞分到96孔板里,然后用接了barcode的Tn5孵育。这样细胞核就被“贴上标签”了。然后把这些标记了的nuclei混到一起进行稀释,重新分配到新的96孔板里,使得每一个孔里有15-25个细胞,每一个孔就成为一个pool,之后用PCR扩增这些pool,进行测序。
基于液滴的方法:与传统的ATAC-seq的方法差不多,只不过裂解的过程在微滴里进行。

这里主讲人重点讲解了10xGenomics平台的scATAC-seq流程。首先将nuclei与Tn5孵育,然后通过一个微滴设备(10xGenomics controller)与gel beads融合,如果你放大看这些gel beads,每一个gel beads都接了一段oligo,这个barcode是唯一的,所以当细胞与这个带有barcode的微滴融合时,每一个细胞都被接上了唯一的标签,方便后续我们可以知道哪些signal是来自哪一个细胞的。之后进行linear扩增,把oil去除,将这些barcodes片段混成pool以便后续文库制备。

scATAC-seq使用tSNE/UMAP来展示结果。比如上图的例子,左上角的峰图是传统ATAC-seq的结果,显示的是所有细胞的平均输出的信号。而在单细胞的tSNE/UMAP结果里,每一种颜色代表一个细胞群,这个细胞群里的所有细胞有着相同的染色质开放区域。上面右图则是每一个细胞群在Slc12a3基因附近的染色质开放情况,这就可以鉴定出哪些细胞群在这个位置是特异开放的。这个方法非常适合那些异质性高的样品,特别是肿瘤微环境。

单细胞ATAC-seq可以解决什么科学问题?
(1)鉴定异质性细胞群里的不同类型的细胞
(2)帮助我们理解肿瘤微环境的构成:
比如:
a)肿瘤微环境里有哪些类型的细胞
b)哪些群体对药物或者其他处理产生应答
(3)在发育过程中,鉴定细胞分化和细胞“轨迹”
(4)构建发育过程中或者疾病过程里的调控网络。

这里主讲人举了个例子:单细胞的ATAC-seq的一个优点,是它可以不依赖于marker基因来鉴定不同细胞群。有一篇文献就是利用scATAC-seq来描述人类血细胞生成过程中的染色体的landscape。文献的作者收集了骨髓和血液样品进行了scATAC-seq实验。它们发现了从血细胞生成的最初阶段到最终阶段存在31种不同的细胞类型,或者说细胞clusters。如果深入挖掘,它们发现了每一个细胞类型的顺式调控因子。发现了每一个细胞类型相关的增强子和启动子并绘制了热图。它们还揭示了plasma B细胞的分化“轨迹”中每一个阶段的调控因子。

另一个例子就是利用单细胞ATAC-seq对肿瘤微环境的分析。样品是来自basal cell carcinoma的患者,这些患者接受了PD-1抑制剂免疫治疗。scATAT-seq可以区分微环境里的免疫细胞、基质细胞、肿瘤细胞(UMAP plot)。文献作者发现所有的基质细胞和免疫细胞都集中在一起(不同的患者之间),而肿瘤细胞则被清楚的分成4个clusters,并且每一个病人里都是specific的。而上图右边的峰图,展示了几个与T细胞活性相关的基因附近的染色质可接近情况。可以看到在不同的肿瘤细胞群中,这几个基因的可接近性是不同的。并且肿瘤细胞群与基质细胞群在这几个基因附近的可接近性也有很大的不同。

但是目前scATAC-seq技术还存在很多挑战,比如:
(1)lysis的实验条件(可能对于不同细胞和组织来说都是specific的)
(2)组织分离的条件
(3)你需要比较大型的仪器,比如流式分选
(4)测序比较昂贵

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