前言：
中国科学家终于成功在“体外”获得了小鼠的功能性精子！为了达到这个目的，研究人员巧妙地将小鼠胚胎干细胞（ESC）诱导分化成功能性的精子（样）细胞，借助辅助生殖技术产生了健康后代。这项工作2016年2月26日凌晨在线发表于干细胞权威杂志Cell Stem Cell 上[1]，为今后治疗男性不育的临床研究搭建了最为简易而可行的平台。
文 | 陈苏仁（中国科学院动物研究所 助理研究员）
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在体外获得有受精能力的生殖细胞一直都是生殖生物学和生殖医学领域的难题和热点。这项研究所建立的系统，能够在体外“复制/模拟”体内精子发生过程，产生功能性精子样细胞。先前的一些研究虽然也报道过成功从“干细胞”诱导分化产生了“生殖细胞”，但未充分评估获得的生殖细胞的功能性。
近年来国际生殖生物学领域同行共同认为“减数分裂”是体外诱导形成精子样细胞的最大障碍，并制定了确定人工获得精子的功能性的“黄金标准”[2]。研究人员必须提供减数分裂特定时期的核DNA含量、染色体数目和各阶段的染色体形态、精子样细胞生产健康后代等有效证据。目前，达到所有以上指标（特别是完成减数分裂）仍然是在体外获得功能性精子的最大考验。
为克服这个壁垒，中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室的周琪院士、赵小阳研究员与南京医科大学生殖医学国家重点实验室的沙家豪教授组成联合研究团队。第一步，将小鼠胚胎干细胞（ESC）诱导分化成原始生殖细胞样细胞（PGCLC）；第二步，研究人员模拟原始生殖细胞（PGC）体内发育的“自然组织环境”，即与睾丸细胞共培养并添加性激素如睾酮等。最终，ESC来源的PGCLC擦除基因印迹，完成减数分裂，最终产生了功能性精子样细胞，具备上述“黄金标准”，借助胞浆内单精注射（ICSI）产生健康后代（如下图）。
今后，研究人员计划在基础研究和临床治疗两方面将这项研究深入下去。一方面，利用这个系统体外研究调控减数分裂的分子机制；另一方面将检测该系统是否适用于其他动物，特别是灵长类动物。当然，这项实验室工作距离临床治疗还长路漫漫，可能的危险性必须排除，使用胚胎干细胞的伦理学问题也需要慎重考量。
辅助生殖技术能不能解决全部的男性不育问题？
不育症是当今社会中较为常见的一类生殖健康疾病，困扰着全球范围内约15%-20%的育龄夫妇，其中男性因素约占一半。男性不育病因复杂，许多遗传与非遗传因素均可致病，患者临床多表现为非梗阻性无精子症和少、弱、畸精子症。精子的形成是一个复杂而连续的生殖细胞分化过程，它起始于原始生殖细胞（PGC）的迁移与增殖，经历精原干细胞（SSC）的自我更新与分化、精母细胞减数分裂和精子变态等重要过程，最终产生“单倍体”功能性精子。
目前，试管婴儿对于大众并不陌生，但是借助这项技术使患有不育症的男性成功当上父亲还是有一个前提条件的——必须有“单倍体”精子。如果男性不育症患者没有“单倍体”精子，辅助生殖技术也束手无策。现实中，的确有相当一部分男性不育症患者经睾丸活检没有“单倍体”精子，仅存在早期发育阶段的生殖细胞，如精原干细胞，部分精母细胞等，这些早期生殖细胞不是“单倍体”，无法直接用于辅助生殖。
从“干细胞（ESC）”到“原始生殖细胞样细胞（PGCLC）”，再到“精子”
最早在2003年，Hans R. Scholer领导的研究组报道了小鼠胚胎干细胞（ESC）可体外经诱导分化产生卵子样细胞。这项开创性研究随即引发学术界的极大关注，因为干细胞居然能够产生生殖细胞?!十多年后的今天，相关研究仍面临一些主要的问题：精子发生是一个非常复杂的生理过程，其中仅有某些阶段可体外“复制”。如前所述，很多研究并未证明人工产生的精子究竟是不是“真正的”精子。
可以说，日本科学家Saitou实验室在方面做出了很大的贡献。Saitou实验室建立了胚胎干细胞（ESC）和诱导型多能干细胞（iPS）分化成为原始生殖细胞样细胞（PGCLC）的黄金方法[3,4]。即先将ESC分化成外胚层样细胞（EpiLCs），之后在生长因子或联合过表达三种转录因子Blimp1、Prdm14和Tfap2c[5]下，约30%的EpiLCs诱导成为PGCLC。但是，PGC样细胞无法继续在体外完成减数分裂，需移植到青春期前受体小鼠睾丸曲细精管中，进行类“体内”精子发生，产生精子和卵子。使用相似方法，人ESC也可分化产生PGCLC[6]。
周琪、沙家豪、赵小阳团队的这项研究，ESC来源的PGCLC真正完全在体外完成了减数分裂，最终产生了功能性精子样细胞，借助辅助生殖技术产生了健康后代。不仅验证了人工产生的精子是“真正的”精子细胞，而且不借助受体鼠睾丸曲细精管移植，完全在体外获得了功能性精子，向ESC到精子的临床治疗又迈出了一步。
能否从不育症患者睾丸少量样本直接获得单倍体精子？
基于胚胎干细胞存在很大的伦理学问题，科学家考虑能否直接通过微创手术获得不育病人的一小块睾丸组织样本，通过体外培养方法直接获得单倍体精子呢？一些研究人员已经在这方面有所尝试。
例如2011年[7]日本科学家Ogawa研究团队利用出生后几天的小鼠睾丸组织小块，置于琼脂块上，气液联合体外培养（添加许多生长因子）最终分化出了单倍体精子，经辅助生殖技术也获得了健康后代。随后[8] Ogawa研究团队利用睾丸组织块培养模型，将精原干细胞（SSC）也诱导产生单倍体精子，并产生了健康的后代。但该项技术效率极低，重复性也存在争议。
2014年[9]上海交通大学仁济医院干细胞中心的何祖平教授研究团队报道了隐睾病人（无单倍体精子）睾丸经消化并体外培养（添加RA和SCF等生长因子），可获得单倍体圆形精子，通过圆形精子注射小鼠卵细胞（因为人的圆形精子注射人卵细胞不能发育）显示受精卵具有一定发育潜能。但是，如何较为高效、稳定地获得功能性单倍体精子仍需大量的基础与临床研究。
参考文献：
1.Zhou Q, Wang M, Yuan Y, Wang XP, Fu R, Wan HF, Xie MM, Liu MX, Guo XJ, Zheng Y, Feng GH, Shi QH, Zhao XY, Sha JH, Zhou Q. Complete meiosis from embryonic stem cell-derived germ cells in vitro. Cell Stem Cell 2016, Published online: February 25.
全文链接：http://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(16)00018-7
2.Handel MA, Eppig JJ, Schimenti JC. Applying "gold standards" to in-vitro-derived germ cells. Cell 2014, 157(6): 1257-1261.
3.Hayashi K, Ohta H, Kurimoto K, Aramaki S, Saitou M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell 2011, 146(4): 519-532.
4.Hayashi K, Ogushi S, Kurimoto K, Shimamoto S, Ohta H, Saitou M. Offspring from oocytes derived from in vitro primordial germ cell-like cells in mice. Science 2012, 338(6109): 971-975.
5.Nakaki F, Hayashi K, Ohta H, Kurimoto K, Yabuta Y, Saitou M. Induction of mouse germ-cell fate by transcription factors in vitro. Nature 2013, 501(7466): 222-226.
6.Irie N, Weinberger L, Tang WW, Kobayashi T, Viukov S, Manor YS, Dietmann S, Hanna JH, Surani, MA. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell 2015, 160(1-2): 253-268.
7.Sato T, Katagiri K, Gohbara A, Inoue K, Ogonuki N, Ogura A, Kubota Y, Ogawa T. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature 2011, 471(7339): 504-507.
8.Sato T, Katagiri K, Yokonishi T, Kubota Y, Inoue K, Ogonuki N, Matoba S, Ogura A, Ogawa T. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications 2011, 2: 472.
9.Yang S, Ping P, Ma M, Li P, Tian RH, Yang H, Liu Y, Gong YH, Zhang ZZ, Li Z, He ZP. Generation of haploid spermatids with fertilization and development capacity from human spermatogonial stem cells of cryptorchid patients. Stem Cell Reports 2014, 3 (4): 663-675.
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