- 更新于2020.10.27
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二代测序方式分为三种：
- single read 单端测序
- paired-end read 双端测序
- mate-pair read 配对测序
虽然有三种方式，但是大多数数据（包括本课题）为双端测序，至于三者之间的差别、优缺点以及适用场合可以自行搜索。接下来讲的内容都是基于双端测序的。
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测序仪原始下机的数据我们称为raw data，二代测序是将DNA片段打断了再测的，每个测序片段我们称为read，质控完的数据称为clean data。既然是双端测序，那么文件就是成对出现的，分别记录reads两端的信息：一般的命名是*.fq1.gz、*.fq2.gz（' * ' 表示通配符），这是一个fastq文件，通常以fq或fastq作为后缀，具体内容下方会介绍。这里我给大家展示我们课题的一个真实数据，给大家看看大小以及命名方式。
原始数据展示 我们可以看到，首先我把我的用户名打码了，呵呵，开个玩笑。
首先这个样本总共有五个文件，这就是公司给的原始数据，我原封不动的上传到了我的服务器上，也没改名也没怎样，我在图片上画了五个蓝色的框，下面是分别代表的意思：
W2018001：是样本的名字，其实我一开始提交给公司的名字是2018001，为什么多了个W我也不知道啊。
NZTD...：这一串是公司自动生成的编号，他们内部使用的，不知道也不需要知道啥意思，不同的公司，可能没有这个
HCV...：flowcell_ID的信息，一般情况下一个样本是一样的
L1：flowcell_lane的信息，图中有L1和L2，这也是为什么一个数据他给我四个文件的原因，他在不同的lane上测的，这里还要注意的一点就是，这个lane的值可能是同一个，就是即使碰到都是L1也是可能的
1，2：分别代表reads的两端
- 我们可以看到，这个30X的WGS的数据量还是很大的，所以为什么他会是压缩文件，不同公司给的命名可能不一样，不过大体不会相差太多，具体命名的含义也可以问问公司的。（注：flowcell_ID、flowcell_lane等信息一般在原始数据的内也可以看到）
- 这里给到的是一个样本2对文件，实际情况是，可能有多对或者只有一对文件，对于这样的情况，我们的处理方式一般是看作一个文件处理，就是merge一下，有见过有些课题组是在这一步直接merge，我的处理方式是后期bam文件再merge。
- 好了，拿到这么一个数据，我们做的第一件事情应该是校验数据的完整性！！！这点很重要，即使一般情况下，传输都不会出错，但这一步还是要做的，怎么去做呢，就看这个截图里的第一个文件MD5.txt，其实这就是一个文本文件，打开了看看是这样的
- 就是这样的四行信息，也就是一个文件名对应一个校验码，最简单的校验方式，linux系统自带的MD5校验命令：
$ md5sum -c MD5.txt
- 这个还是需要一点点时间的，大家要耐心等待。展示一下我这里的结果吧（其实在上传完数据的时候我就校验过）
好了，校验完了，没问题，那么就给大家介绍一下文件的格式。
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fastq文件是什么呢，其实就是文本文件，可以直接查看，以下是示例：fastq格式
一条read一条记录，一条记录占四行，第一行是注释，第二行是序列，就是我们所说的ATCG碱基序列，第三行是‘+’，第四行是对应的每个碱基的测序质量，也就是fastq中的“q”。每条记录之间是没有空格的。
贴一下关于第一行的解释
| EAS139 | The unique instrument name |
|---|---|
| 136 | Run ID |
| FC706VJ | Flowcell ID |
| 2 | Flowcell lane |
| 2104 | Tile number within the flowcell lane |
| 15343 | 'x'-coordinate of the cluster within the tile |
| 197393 | 'y'-coordinate of the cluster within the tile |
| 1 | Member of a pair, 1 or 2 (paired-end or mate-pair reads only) |
| Y | Y if the read fails filter (read is bad), N otherwise |
| 18 | 0 when none of the control bits are on, otherwise it is an even number |
| ATCACG | Index sequence |
第一个是测序机器ID，独一无二的，你可以去illumina官网查到的（我没查过）
第二个是这个机器跑的次数，一般机器都是有使用寿命的，所以次数越多肯定结果越差，那么一般在什么区间合适呢，我的老师给的建议是200-9999，为啥还有下限呢，那是因为，机器刚开始跑的那几次，需要磨合嘛，不是很准。看来这个展示数据不是很好啊，吓得我赶紧去看了下我的数据，还好，在212次（懒得贴图了，简书弄个图真麻烦），在范围内。
倒数第三个，表示数据有没有被过滤过，一般我们的原始数据肯定是N的，要是给的原始数据是Y，你就得好好问问公司原因了。
其余具体的我就不解释了，有问题可以评论交流。
第二行要注意的是，可能有N的出现，那是因为有些碱基没被测出来。
第四行是ASCII码表示的碱基质量，这样就能保证质量是用一个字符表示的，和碱基一一对应。公式如下：
P=10^-[(n-33)/10]举个栗子：比如“?”在ASCII码表上对应的编号是63，那么n就是63，减去33以后就是30，也就是我们说的Q30了，所以
Q = n - 33，P算出来就是0.001，这个就是错误率，反过来，准确率就是99.9%，Q30就是准确率99.9%，同理Q20就是准确率99%。
- ok，介绍完格式，介绍两款质控的软件，fastqc和fastp
fastqc：
$ wget http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.11.7.zip
$ unzip fastqc_v0.11.7.zip
$ cd FastQC/
$ chmod 755 fastqc
fastp：
$ wget http://opengene.org/fastp/fastp
$ chmod 755 fastp
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以上是我的安装方式，fastqc是一个很常用的软件，我想只要不是小白都用过。对于ubuntu用户请用我提供的方式进行安装，用
apt-get install fastqc可能在使用的时候出现如下报错
fastqc错误 至于fastp，是用来清洗质量不好的reads的，其实类似的软件很多，包括trimmomatic等，之所以选择这个是因为用过那么多软件后，发现fastp无论在安装还是使用上都很顺手，仅此而已。（注：fastp的UMI操作可能导致结果不能复现，详见issue）
好了，现在让我们来使用fastqc对raw data的质量进行分析并查看
$ fastqc [-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] seqfile1 .. seqfileN
#这是fastqc的使用方法，其实很简单，对于不懂的软件，我一般的推荐是，先看官方说明，再逛逛论坛，这里不展开说这个软件怎么使用了，下面是我的使用代码
$ fastqc -o your/path/to/out -t 4 ${datadir}/*.fq.gz
#是不是超级简单，-o是报告输出的目录，这个目录必须是存在的，-t是线程数
- 结果如下，要放在早几年，估计是很难见到这么干净的原始数据了，为此我还专门请教了一些老师，这么干净的数据的可信程度。得益于illumina公司对仪器的升级改善，数据的质量也是越来越好了。
- 但是即便如此，我们还是要对raw data进行清洗的，数据的质量直接决定了后面分析的准确性，是一切分析的前提，我们一直都在说QC，QC也是基础，但是它的重要性不容忽视。下面是我要查看的质控的内容：
- read各个位置的碱基质量值分布
- 碱基的总体质量值分布
- read各个位置上碱基分布比例，目的是为了分析碱基的分离程度
- GC含量分布
- read各位置的N含量
- read是否还包含测序的接头序列
- 下面是我的对于clean data的指标：
- 将含有接头的reads对去除，或者cut接头
- 测序错误率分布检查，一般情况下，每个碱基位置的测序错误率都应该低于1%
- GC含量，理论上A=T，C=G，前几个碱基可能会有波动，GC含量整体在41.5%左右
- 平均质量值分布：Q30平均比例≥80%，平均错误率≤0.1%
- 为了达到这样的目标，我的筛选是条件是：
- 去除含接头（adapter）的一对reads；可以酌情考虑去除接头保留reads
- 当某一端read中的N含量超过该条read长度比例10%，去除该对reads
- 当某一端read中低质量（Q≤20）碱基数超过该read长度比例的50%时，去除该对reads
$ fastp -i 1.fq.gz -I 2.fq.gz \
--adapter_sequence ${Adapter_R1} \
--adapter_sequence_r2 ${Adapter_R2} \#不同的试剂盒、仪器，会有不同的接头，这个可以咨询公司，也可以选择去掉这两个参数，影响不大
-o your/path/of/data/cleaned.1.fq.gz \
-O your/path/of/data/cleaned.2.fq.gz \#输出的clean data的位置和名称
-c -q 20 -u 50 -n 15 -5 20 -3 20 -w 16 \
-h your/path/of/report/clean.html -j your/path/of/report/clean.json #这俩参数分别是不同格式报告的输出位置和文件名
- 别的不多说，解释一下我用到的几个参数，
- -c：对overlap区域进行纠错，适用于PE
- -q：设置低质量的标准，默认是15，多数公司这里设为5
- -u：低质量碱基所占比例，默认40代表40%，只要有一条read不满足条件就成对丢掉
- -n：过滤N碱基过多的reads，15代表个数，因为一般PE150的reads长度是150
- -w：线程数，这里要注意！范围是1-16，建议是8，亲测，8和16差不多。
- -5 -3：根据质量值来截取reads，分别对应5‘端和3’端，得到reads长度可能不等
- 具体请参考官网说明。
- 这个时候再看clean data结果，就无需fastqc了，因为fastp也会生成一份报告。
- 看到结果，其实可以发现，数据还是保留了大部分的，所以完全不用担心cut太狠，导致数据不够。我的原则是，在数据量面前，更应该保证的是数据的准确性，即使会有一点损失，也是值得的，毕竟research更注重的也是准确性，相对于降低假阴性，我更倾向于提高真阳性。
- 那么得到clean data以后就可以进行下一步mapping了，mapping内容下次再与大家分享。
- 水平有限，要是存在什么错误请评论指出！请大家多多批评指正，相互交流，共同成长，谢谢！！！
