欢迎关注同名公主号：BBio
//文献
2020年发表于Cancer Cell，影响因子31.743，一篇非典型的scRNA文章，大量的实验验证佐证了分析结果，对于深入挖掘一个基因影响一个通路的机制有一定借鉴意义。
MYC drives temporal evolution of small cell lung cancer subtypes by reprogramming neuroendocrine fate
//摘要
小细胞肺癌(SCLC)是一种临床上作为单一疾病治疗的神经内分泌肿瘤，预后不良。基于 ASCL1、NEUROD1、POU2F3 或YAP1 的表达可以定义不同的SCLC分子亚型。文章使用不同时间点小鼠和人类模型，通过单细胞转录组揭示MYC基因驱动 SCLC 亚型。在神经内分泌细胞中，MYC 激活 Notch 以去分化肿瘤细胞，促进 SCLC 从ASCL1+到 NEUROD1+再到 YAP1+状态的转移。MYC也可促进来自不同细胞类型的POU2F3+肿瘤。人类SCLC表现出肿瘤内亚型异质性，表明这种动态演变发生在患者肿瘤中。
//前言
大量的研究都已表明SCLC可以通过四个转录因子的表达分为不同的亚型，ASCL1 (SCLC-A)、NEUROD1(SCLC-N)、POU2F3(SCLC-P) ， YAP1(SCLC-Y)。SCLC_ASCL1亚型占比70%左右，ASCL1是一个神经内分泌细胞(NE)命运的主要调节因子，MYCL高表达。另外三种亚型高表达MYC，并且逐渐失去NE的分子特征。
Notch在SCLC中是一种肿瘤抑制因子，约25%的肿瘤存在Notch受体功能丧失的改变，在肺损伤时，Notch2标记一个NE-干细胞群在Notch缺失的情况下进行自我更新。
虽然MYC和NOTCH都与SCLC的non-NE细胞命运有关，但MYC和NOTCH之间的功能关系并不清楚。文章主要研究了MYC在SCLC亚型的起源和关系中的作用。
//分析思路
//主要结果
- 问题：MYC驱动了哪些SCLC亚型？
分析不同时间点Myc-driven(RPM)和Mycl-driven(RPR2)SCLC小鼠模型的肿瘤，早期NE marker高表达，后期扩散性的RPR2肿瘤仍维持高表达，RPM肿瘤中的表达显著下降，非NE marker NEUROD1, YAP1, HES1, ZEB1, CD44 表达升高，MYC在扩散性RPM中高表达，而在RPR2中没有检测到。有趣的是，POU2F3很少在来自PNECs的RPM肿瘤中检测到。然而，RPM小鼠启动子中一般启动子(Ad-CMV-Cre)，非club或者AT2启动子，在表达POU2F3的肿瘤中富集。
表明MYC在SCLC-N、-Y、-P中的高表达和已报道的研究结果一致，MYC可能是不同SCLC亚型的驱动因素。
- 问题：SCLC不同亚型潜在的时空联系是怎么的？
取ASCL1+阳性的RPM原位肿瘤组织进行细胞培养，肿瘤细胞最初形成紧密、圆形、球形的聚集物，类似经典的高NE特性的人类SCLC细胞系，最终形成链式的非NE的细胞，而RPR2肿瘤细胞没有变化。不同时间点收集的细胞依次表达ASCL1、NEUROD1、YAP1等。并通过在RPR2肿瘤细胞系中表达Myc，证明MYC促进了RPR2肿瘤细胞系向非NE转变。
- 问题：人和小鼠中MYC的驱动进化是否一致？
通过bulk测序证明不同时间点的肿瘤细胞分别高表达各亚型的信号。
- 问题：SCLC亚型是否沿着单一轨迹发展？
使用Day4-21 6个不同时期的肿瘤细胞系进行单细胞测序。在Day4-7的细胞群中，Ascl1和NE marker大量表达，而在Day11-21的细胞中，非NE marker大量表达。
使用4个扩散性的肿瘤样本和上面细胞系中肿瘤细胞一起进行拟时序分析，少部分细胞进入到晚期阶段，RPM2-4肿瘤在较晚的时间点有更多的细胞，这与RPM1的ASCL1水平较低，YAP1蛋白表达较高是一致的。top500个差异表达基因在拟时间内的表达表现为NE基因的广泛缺失和非NE基因的获得。并使用 diffusion map的结果进一步验证Monocle的结果。
- 问题：MYC驱动的不同亚型肿瘤内异质性怎样？
拟时间分析表明，单个RPM肿瘤由代表多种SCLC亚型的细胞组成。通过分析单个RPM肿瘤的原位或侵袭期的系列切片，也说明了不同亚型组成的异质性。通过CIBERSORT解卷积分析10个RPM肿瘤也证明了MYC驱动进展的肿瘤内异质性。
- 问题：MYC如何在NE去分化中激活Notch信号？
使用scRNA-seq数据进行了差异基因表达分析，并使用ENRICHR分析对top差异基因进行富集分析，鉴定到了影响SCLC命运重要的转录因子，包括REST, SUZ12, TCF3, NEUROD1, NHLH1, MYC, SOX2。Notch/Rest 信号可以促进SCLC的非NE命运，使用人源的NE基因集鉴定每个细胞的NE-score，发现随着时间的推移，NE-score准确地预测了NE-identity的下降，在第7天至12天之间，NE-score显著下降。
进一步分析转变过程中Notch信号相关的机制和靶基因，发现Notch抑制因子在早期表达较高，包括Dll3, Hes6, Fbxw7 ,Ncor2，相反促Notch信号基因随着时间表达增高，包括Notch靶基因Hes1,Rest,Notch2。对Bulk-RNA
数据进行GSEA分析发现晚期相对于早期Notch信号活性增强，而REST转录靶基因集受到抑制。多个Notch信号中的基因在Chip-seq数据中鉴定为MYC的靶基因。这些数据表明MYC增加NOTCH/REST活性在MYC驱动的SCLC进化过程中改变NE特性。
- 问题：Notch信号激活在MYC驱动的肿瘤进化中是否必须？
将早期RPM肿瘤细胞在gamma-secretase inhibitor下培养(如DAPT)来阻断Notch信号，并设置非阻断的对照。发现DAPT处理的RPM细胞并没有转变为其它的形态，并且和对照相比，ASCL1, INSM1, EPCAM, NEUROD1的表达增加。
