研究背景

结合DSP技术解析复杂的肿瘤微环境

在当今生物科技的快速发展下，对于恶性肿瘤的免疫治疗已经取得了很大进展，但肿瘤内异质性(ITH)对免疫治疗的抑制机理还不清楚。为了进一步探究肿瘤微环境以及肿瘤内异质性（ITH）对于肿瘤生长的影响，研究人员采用DSP（digital spatial profiling）蛋白和CTA检测方案，结合特定细胞类型的圈选策略对18例接受双特异性抗体（bsAb）治疗的非小细胞肺癌晚期患者（NSCLC）进行样本分析，并分别获得了肿瘤区域和基质区域蛋白组和转录组表达谱，在空间水平解析了瘤内异质性。通过比较基质区域和肿瘤区域中预测临床疗效的空间标志物分子评分，发现基质区域的分子特征对治疗反应有更大的预测能力。

研究方法与样本选取

图1 DSP实验样本处理流程

（1）样本：来自18名接受KN046治疗的晚期NSCLC患者的20个肿瘤样本

（2）技术：GeoMx DSP

（3）检测panel：

● 空间转录组检测：CTA panel，包含肿瘤相关的1800种RNA；

● 空间蛋白组检测：4个蛋白检测模块，包括：Immune Cell Profiling Core，Pan-Tumor Module，Immune Cell Typing Module和IO Drug Target Module，共包括44种靶标蛋白和6种内参蛋白；

（4）感兴趣区域（ROI）圈选方案：136个肿瘤 AOI和70个基质AOI通过细胞类型圈选方式进行区域圈选：形态学标记（panCK（上皮细胞），CD45（免疫细胞）, SYTO 13（细胞核））对组织进行染色，识别和区分组织中的肿瘤细胞和基质细胞，获得其各自表谱；

（5）实验流程：对目标NSCLC 患者（18- 75岁），每14天静脉注射 bsAb- KN046，直到疾病进展或达到患者达到忍耐最大限度。并对样本肿瘤组织进行FFPE切片，DSP蛋白分析和RNA分析。经过样本制备、ROI圈选、空间蛋白组学和空间转录组学等数据分析后，得出了相应结果。

实验结果分析

（1）DSP识别肿瘤内空间AOI表达模式不同：

为了评估 ITH，研究人员分析了同一样本基质细胞及肿瘤细胞RNA和蛋白的表达具有明显差异，分为两个独立的聚类。研究人员推测空间上相邻的肿瘤区域在分子水平上会有更高的相似性，为了证明该推测，研究人员对12个肿瘤样本进行分析。结果发现，在这12个样本中，8个样本中肿瘤AOIs的空间距离与分子聚类模式具有一致性，并且同一ROI中的肿瘤与间质细胞的表达谱比不同区域的表达谱更相似。

图2 肿瘤内不同AOI的表达形式

（2）肿瘤和间质AOI免疫细胞类型和通路的表征：

实验人员又进行了淋巴细胞浸润性评估。肿瘤细胞富集的区域大部分缺乏免疫细胞，因此我们观察到肿瘤区域中淋巴细胞的丰度明显低于基质区域(p<0.001)。在基质区域中检测最多的细胞类型巨噬细胞、CD4 T细胞、成纤维细胞、单核细胞、B细胞和CD8 T细胞。研究人员又对每个样本的 AOIs 表达程序进行了评估，发现肿瘤区域与癌症相关的细胞功能复杂程度要显著高于间质区域。

图3 肿瘤和间质区域中免疫细胞类型和癌变途径的表征

（3） DSP标记物的鉴定揭示ITH对筛选生物标志物的影响：

为了评估ITH对筛选与疗效相关生物标志物的影响，研究者通过DSP研究bsAb-KN046对肿瘤治疗的效果。研究人员将每个肿瘤样本的所有AOIs蛋白表达数据进行平均，模拟整体测序数据，并与空间segmentation的结果进行比较。共有18个DSP蛋白标记物分别在间质区和肿瘤区被鉴定出来，其中只有4个蛋白（CD45、CD4、34GITR和CD11c）在模拟测序数据中表达，并且这4种蛋白在PR组中的表达增加。为了进一步验证不同区域内蛋白的表达情况，研究者对PR组和PD组中基质区4种蛋白（CD11c、Tim-3、CD45、CD4）进行mIHC验证，发现基质区PR组上述4种蛋白的表达均显著高于PD组。在不同免疫浸润反应组的患者，也发现四种免疫细胞（CD4 T细胞，树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞）在PR组中丰度更高。

（4）空间数据显示基质区域比肿瘤区域具有更大的临床反应相关性：

考虑到ITH对免疫治疗的作用，研究者通过构建疗效相关的DSP蛋白标记物的空间signature得分，评估间质和肿瘤区域生物标志物的临床相关性。结果显示，PD患者和PR患者在肿瘤区和间质区的signature评分具有显著差异。为了进一步探究间质和肿瘤特征在对临床的影响，研究人员采用多因素Cox回归分析了多种表征对临床结果的影响。结果显示，与传统的肿瘤生物标志物相比，间质signature显示出更强的临床相关性。之后研究者通过收集65例接受ICIs治疗的NSCLC患者的基质区数据，进一步验证了空间signature的有效性。这些结果表明，来自基质区域的分子在评估免疫治疗的临床疗效方面可能具有更大的潜力。

图4 构建空间signature预测对免疫治疗的临床反应

研究结论

在bsAb免疫治疗的不同治疗组中，基质区显示出更多的差异遗传信息，基质区构建的标记具有更高的预测效率。

本研究通过使用DSP空间组学技术，对PR和PD不同样本组患者的不同组织区域进行了ROI圈选，并对ROI中的转录组和蛋白组信息进行了分析。结果表示，同一样本统一区域内的肿瘤和基质区域都表现出明显的特征，在肿瘤区域和机制区域识别出多个分子对治疗反映相关，并筛选出18个相关蛋白可作为预测bsAb的生物标志物。此外通过对肿瘤区域以及基质区域的AUC值（分别为 0.838 和 0.786）进行分析可得知，在临床治疗中基质区域的分子特征对治疗反应有更强的预测能力。

参考文献：

Song X, Xiong A, Wu F, et al. Spatial multi-omics revealed the impact of tumor ecosystem heterogeneity on immunotherapy efficacy in patients with advanced non-small cell lung cancer treated with bispecific antibody. J Immunother Cancer. 2023;11(2):e006234. doi:10.1136/jitc-2022-006234