N6-methyladenosine induced miR-143-3p promotes the brain metastasis of lung cancer via regulation of VASH1
这是2019年12月发表在Mol Cancer上的关于“N6-甲基腺苷诱导的miR-143-3p通过调控VASH1促进肺癌脑转移”的文章。通讯作者是中山大学肿瘤防治中心肿瘤内科的陈丽坤教授。
研究背景
脑转移(BM，Brain metastasis) 发生在 20-40% 的晚期癌症中，是最常见的成人颅内恶性肿瘤之一，诊断后的生存期不到 12 个月。约 40% 的肺腺癌 (LAD) 患者在其患病期间的某个时间点最终患上 BM，是肺癌患者发病和死亡的主要原因之一。
microRNAs (miRNAs) 是一种 18-25 nt 的小非编码 RNA，通过与靶mRNA 的3‘-非翻译区（3’-UTR）结合，抑制翻译和/或负调控mRNA的稳定性，发挥肿瘤致癌基因或抑制基因的作用。
主要内容
miR-143-3p与BM和肺癌进展相关
为了识别肺癌BM 中涉及的潜在 miRNA，作者使用mercury LNA™ microRNA Array 分析了 6 对匹配的原发性肺癌和 BM 组织中的 miRNA 表达谱。与倍数大于 2 的原代组织相比，BM 组织中有 20 种 miRNA 上调，4 种 miRNA 下调（图1A）。在上调的 miRNA 中，与匹配的原发性肺癌组织相比，每个 BM 组织中只有 miR-27b、miR-143-3p 和 miR-145 上调（图 S1A、B、C） 。然后，作者通过原位杂交(ISH) 检查了 miR-27b、miR-143-3p、miR-145 和 miR-192 在有 ( n = 10) 或没有 ( n = 10) BM 的原发性肺癌组织中的表达。结果显示，与阴性患者相比，只有miR-143-3p 在 BM 阳性肺癌患者中显著增加（图1B)。迪米特洛娃等表明miR-143/145 在肿瘤间质中的表达促进了肺肿瘤的发生。ISH结果显示miR-143-3p可在有或无BM的肺癌组织的基质和肿瘤细胞中检测到，而miR-143-3p在肿瘤细胞中的水平高于基质细胞（图 S1D）。所有这些结果表明转移性肺癌细胞和组织中 miR-143-3p 表达的有内在的增加。
因此，作者检查了miR-143-3p 与肺癌进展之间的关联。 66例肺癌患者根据ISH结果分为miR-143-3p阳性（+，n = 38）和阴性（-，n = 28）组（表S2）。作者的数据显示，miR-143-3p 在 BM+ (25/34) 中的表达显著（p < 0.01，χ2检验）高于BM- (13/32) 肺癌患者。此外，与miR-143-3p- 患者相比，miR-143-3p + 肺癌患者显示出显著（p < 0.05，t检验）更高水平的癌胚抗原（CEA，图 1c) 和诊断时的肿瘤直径（图 1d) 。提示肺癌恶性转化过程中miR-143-3p表达呈上升趋势。未观察到肺癌患者的性别、年龄或 T/N 分期存在显著差异（表S2 和图 S1E）。使用在线生物信息学工具 Kaplan-Meier 绘图仪（图 1e) 和来自 TCGA 数据库的数据（图 1f)，作者发现miR-143-3p 水平升高的肺癌患者的总生存期 (OS) 降低。这表明miR-143-3p与BM和肺癌的进展相关。
miR-143-3p 触发 EMT、BBB 模型的侵袭和肺癌的血管生成
然后，作者评估了已鉴定的miRNA 在肺癌进展中的潜在功能。作者用miR-27b、miR-143-3p、miR-145 和 miR-192 构建体转染 A549 细胞（图 S2A）。伤口愈合试验表明，在所有测量的 miRNA 中，miR-143-3p 具有最大的促进 A549 细胞体外迁移的能力（图 1a，图 S2B）。qRT-PCR显示，与人支气管上皮细胞（HBEC）相比，miR-143-3p在肺癌细胞中的表达上调，而miR-143-3p在内皮细胞如HBMEC、HUVEC和PAEC 细胞与肺癌细胞中的相当或稍大（图2b）。在测量的肺癌细胞中，H1299 的 miR-143-3p 水平最高，而 H1975 的 miR-143-3p 水平最低（图 2b）。miR-143-3p 的过度表达也触发了 H1975 细胞的伤口闭合（图 S2C）。体外 transwell 试验证实 miR-143-3p 可以触发 A549 和 H1975 细胞的侵袭（图 2C）。此外，A549 细胞中 miR-143-3p 的过度表达失去了它们的鹅卵石样上皮形态，并呈现纺锤状成纤维细胞外观，而 miR-143-3p 抑制剂显示出相反的形态变异（ S2D ）。作者进一步评估了转染或未转染miR-143-3p 的细胞中细胞迁移和 EMT 相关生物标志物的表达。数据显示，miR-143-3p可以降低A549细胞中E-Cad的表达，同时增加FN、Vim、MMP2和MMP-9的表达（图2d）。根据前期研究，作者进一步利用人脑微血管内皮细胞（HBMEC，图2e）建立了体外血脑屏障（BBB）模型。作者的数据表明，miR-143-3p 可以通过 A549 和 H1975 细胞的体外 BBB 模型增加侵袭性（图2F）。这些结果表明，miR-143-3p 的过表达可以通过肺癌细胞的体外 BBB 模型增加传播和侵袭力。
然后作者研究了miR-143-3p 在肺癌细胞增殖中的作用。结果显示，miR-143-3p 在转染 24 小时后对 A549 或 H1975 细胞的增殖没有影响（图 S2E）。处理 3 天后，miR-143-3p 的过度表达可以轻微但不显著降低A549 的增殖（图 S2F）。克隆形成试验表明，miR-143-3p 的过表达或抑制剂对 A549 细胞的定植没有影响（图 S2G）。这些数据表明 miR-143-3p 对肺癌细胞的增殖和定植的影响有限。
作者通过管形成试验进一步检查了miR-143-3p 在肺癌细胞血管生成中的潜在作用，因为新血管生成是癌症 BM 的标志。结果显示，转染miR-143-3p的A549和H1975细胞的条件培养基显著促进了HUVECs的管腔形成（图2G）。此外，miR-143-3p 的过表达可以增加 A549、H1975、H292 和 H1650 等肺癌细胞中 VEGFA 的表达（图 2H）。这些结果表明miR-143-3p可以增加肺癌细胞中血管生成和VEGFA的表达。
然后作者检查了miR-143-3p 抑制剂对体外 BBB 模型的侵袭和 H1299 细胞血管生成的潜在作用，因为它具有最高水平的 miR-143-3p（图2b). 作者的数据表明，miR-143-3p 抑制剂可以通过 H1299 细胞的 BBB 模型显著降低体外侵袭力（图2i）。一致地，转染miR-143-3p 抑制剂可以抑制 HUVEC 的管形成（图2j）和VEGFA在H1299细胞中的表达(图2k). 进一步证实了miR-143-3p对肺癌进展的促进作用。
VASH1 介导 miR-143-3p 诱导的细胞传播和血管生成
miR-143-3p 的潜在目标是通过组合使用五个不同的基于网络的数据库（miRanda、miRDB、miRwalk、RNA22 和 TargetScan）预测的。在来自 5 个数据库（表 S3）的 25 个已识别目标中，作者分析了癌症转移或血管生成相关基因的mRNA表达，包括VASH1、USP54、WASF3、GABRB3 、转染 miR-143-3p 的细胞中的IGFBP5 和 HK2。miR-143-3p 的过表达降低了 A549 中 VASH1 的表达，而不是其他的表达（图3a) 和 H1975 (图3b) 细胞。miR-143-3p 还可以降低 A549 细胞中 WASF3 的表达（图3A）。考虑到 WASF3 的下调可以抑制癌症进展，作者进一步研究了VASH1 在 miR-143-3p 诱导的肺癌进展中的潜在作用。一致地，miR-143-3p 的过表达也可以降低 H292、H1650 和 H1299 细胞中 VASH1 的mRNA表达（图S3A）。蛋白质印迹分析证实，miR-143-3p 的过表达可以降低所有测量的肺癌细胞中 VASH1 的表达（图3C）。一致地，miR-143-3p 抑制剂可以增加 A549 和 H1975 细胞中 VASH1 的表达（图 S3B）。在所有测量的肺癌和 HBEC 细胞中，miR-143-3p 的相对表达与 VASH1 的相对表达呈负相关（图 3d)。 数据显示miR-143-3p可以负向调节VASH1的表达。
作者进一步研究了miR-143-3p 是否可以直接靶向 VASH1 的mRNA。在VASH1 的 3'UTR 中观察到三个潜在的结合位点（图3e）。作者克隆了VASH1 的野生型 3'UTR 以生成 pmiR-GLO-WT，并分别突变了三个潜在的结合位点（UCAUCUC 到 UA A CA U U），以生成pmiR-GLO-Mut-a/b/c。正如预期的那样，荧光素酶测定显示 miR-143-3p 的过度表达可以显著降低野生型报告基因活性，然而，所有三种突变体都可以挽救miR-143-3p 诱导的荧光素酶活性下调，其能力依次为Mut-a > Mut-b > Mut-c (图3F）。在 H1299 细胞中，miR-143-3p 抑制剂可以增加野生型报告基因活性，而三种突变体可以挽救 miR-143-3p 诱导的荧光素酶活性上调（图 S3C ）。总的来说，这些结果表明VASH1 是肺癌细胞中 miR-143-3p 的直接靶标，位点“a”是 miR-143-3p 结合的最重要位点。
作者进一步评估了VASH1 是否参与了 miR-143-3p 调节的细胞传播和血管生成。伤口愈合试验表明，VASH1 的过表达可以显著挽救miR-143-3p 诱导的 A549 细胞迁移（图 S3D）。Western blot 分析显示 miR-143-3p 诱导的 E-Cad 下调和 FN 的上调被 VASH1 的过表达减弱（图3G）。体外 BBB 模型证实，通过 A549 细胞的体外 BBB 模型，VASH1 的过表达可以显著挽救miR-143-3p 增加的侵袭性（图3H）。此外，转染 VASH1 的 A549 条件培养基可显著减弱miR-143-3p 诱导的 HUVEC 管形成（图3i）。这些结果表明VASH1 参与 miR143 促进肺癌细胞的传播和血管生成。
VASH1 通过破坏 VEGFA 介导 miR-143-3p 诱导的血管生成
VASH1 通过诱导VEGFA表现出反馈抗血管生成活性，但机制尚不清楚。在肺癌细胞中，VASH1 的过度表达可以降低通过蛋白质印迹分析测试的 A549 和 H1975 细胞中 VEGFA 的表达（图4a) 或 ELISA（图 S4A）。此外，VASH1 的过表达可以减弱 miR-143-3p 诱导的 A549 中 VEGFA 的上调（图4b) 和 H1975（图 S4B）细胞。尽管 VEGFA 在血管生成中的促进作用已得到充分说明，但作者通过在有或没有重组VEGFA (rVEGFA)的情况下处理HUVEC 细胞，进一步研究了 VEGFA 是否参与 miR-143-3p 调节的肺癌血管生成。作者的数据显示rVEGFA 可以增加 HUVEC 的管形成并进一步挽救 VASH1 抑制的管形成（图4C）。提示 VASH1 参与 miR-143 调控的 VEGFA 表达和肺癌血管生成。
进一步研究了导致VASH1 抑制 VEGFA 的机制。作者的数据显示VASH1 和 miR-143-3p 都不能影响 A549 细胞中 VEGFA 的mRNA表达（图4d）。此外，VASH1 的过表达对 VEGFA 的mRNA稳定性没有影响（图S4C）。说明VASH1调控VEGFA的表达是由于转录后调控。作者进一步进行了线性蔗糖梯度分级分离以评估多核糖体和VEGFAmRNA之间的关联，以研究VASH1 是否可以调节 VEGFA 的mRNA翻译。如图4e所示，VASH1 的过表达对 VEGFA mRNA在含有翻译休眠复合物和翻译多核糖体的两个部分中的分布没有显著影响，这表明没有翻译变异。因此，VASH1 对 VEGFA 的减少似乎发生在翻译后水平，而不是其翻译的调节。
然后作者研究了VASH1 是否可以直接与 VEGFA 相互作用以影响其表达。Co-IP 显示 VASH1 不能与 A549 细胞中的 VEGFA 结合（图 S4D）。蛋白质稳定性测定显示 VASH1 可以降低 A549 细胞中 VEGFA 的半衰期（图4F）。转染或未转染 VASH1 的 A549 细胞中 VEGFA 的半衰期分别为 8.1 和 2.9 小时。为了进一步证实 VASH1 翻译后抑制 VEGFA 的表达，转染或不转染 VASH1 的 A549 细胞进一步用 MG132 处理以抑制蛋白酶体活性或用 CHX 处理以阻断翻译。数据显示 MG-132 可以减弱 A549 细胞中 VASH1 抑制的 VEGFA 表达，而 CHX 没有类似的作用（图4G）。由于泛素化对于蛋白酶体介导的蛋白质降解至关重要，作者假设VASH1 可能会改变 VEGFA 的泛素化。免疫沉淀结果显示，在 VASH1 转染的 A549 细胞中，VEGFA 的泛素化显著增加（图4H）。这表明 VASH1 可以增加肺癌细胞中 VEGFA 的泛素化介导的蛋白酶体降解。这些数据表明 VASH1 介导的 miR-143-3p 通过破坏 VEGFA 蛋白来诱导血管生成。
VASH1 介导 miR-143-3p 诱导的微管解聚
VASH1 能编码微管蛋白脱酪氨酸活性。α-微管蛋白的可逆酪氨酸化/脱酪氨酸化对微管 (MT) 的稳定性和动态性及癌细胞的侵袭很重要。首先，miR-143-3p 的过表达可以降低 A549 细胞中脱酪氨酸微管蛋白(deY-Tub)的水平（图5A）。一致地，miR-143-3p 抑制剂可以增加 H1299 细胞中 deY-Tub 的水平（图 S5A）。此外，VASH1 的过表达可以消除 miR-143-3p 减少的 A549 细胞中的 deY-Tub（图 5A）。miR-143-3p 和 VASH1 都不能影响总 α-微管蛋白的蛋白表达（图5A）。共聚焦结果显示，在 miR-143-3p 过表达细胞中 VASH1 的表达降低，然而，VASH1 在对照和 miR-143-3p 过表达细胞中与 MT 共定位（图5b)。
确定miR-143-3p 可以通过调节 VASH1 来调节 α-微管蛋白的去酪氨酸化，作者接下来确定它是否会影响聚合的微管群。作者使用针对α-微管蛋白和 deY-Tub 的抗体对 A549 细胞进行染色。deY-Tub 的信号与野生型细胞中的 MMT 共定位，此外，deY-Tub 的表达在 miR-143-3p 过表达细胞中降低（图 5C）。
为了证实deY-Tub 是否参与了miR-143-3p 调节的肺癌细胞迁移，作者用紫杉醇(PTX，可导致各种细胞中α-微管蛋白脱酪氨酸的强烈增加) 处理细胞 。一致地，PTX 可以钝化 miR-143-3p 抑制的 deY-Tub 在 A549 细胞中的表达（图 15d）。此外，伤口愈合试验（图 S5B）和体外 BBB 模型（图5e) 显示 PTX 可以分别显著减弱miR-143-3p 触发的 A549 细胞 BBB 模型的迁移和侵袭能力。这表明 VASH1 诱导的 α-微管蛋白去酪氨酸化参与了 miR-143-3p 触发的肺癌细胞的传播和 BM。
α-微管蛋白乙酰化或脱酪氨酸化通常标志着稳定的 MTs 。为了研究 VASH1 与 MT 的关联是否影响它们的动态特性，作者用诺考达唑处理A549 细胞并监测诺考达唑洗脱后 MT 的再生长。对照细胞中聚合的 MT 纤维在洗脱后 10 分钟就已经很明显了，然而，在 miR-143-3p 稳定细胞中，诺考达唑洗脱后 120 分钟检测到 MT 纤维（图5F）。VASH1 的过表达可以加速聚合并减弱 miR-143-3p 延迟的 MT 聚合（图 5F）。蛋白质印迹分析证实，与对照细胞相比，deY-Tub 在 miR-143-3p 稳定细胞中的表达延迟，而 VASH1 的过表达可以减弱这种延迟效应（图 5G）。接下来，作者通过用增加浓度的诺考达唑处理对照或miR-143-3p 稳定细胞来分析 miR-143-3p 对 MT 解聚的影响。在对照细胞中，MT 在 5 μM 浓度下开始部分解聚（仍然可检测到一些 MT 纤维），并且使用 10 μM 诺考达唑实现了完全解聚。而 1 μM 诺考达唑诱导 miR-143-3p 稳定细胞中 MT 纤维的部分解聚。此外，5 μM诺考达唑足以诱导完全解聚（图S5C）。此外，用 1 μM诺考达唑处理不会改变对照细胞中的deY-Tub 水平，同时降低 miR-143-3p 表达细胞中的 deY-Tub 水平（图S5D）。这表明 miR-143-3p 可以通过依赖 VASH1 的方式调节 deY-Tub 来影响 MTs 的聚合。
为了证实VASH1 介导的 α-微管蛋白脱酪氨酸化参与 miR-143-3p 诱导的 MT 重编程和细胞传播，作者生成了VASH1 突变体 VASH1-Cys169Ala，这已被证明对于依赖 VASH 的 deY-Tub 诱导至关重要。作者的数据显示VASH1-C169A 未能挽救 miR-143-3p 减少的 A549 细胞的 deY-Tub（图5H）。此外，VASH1-C169A 的过度表达未能减弱 miR-143-3p 破坏 MT 网络的稳定性（图5f) 和 miR-143-3p 触发了体外 BBB 模型的入侵（图5i）。此外，VASH1-C169A对A549细胞E-Cad和FN的表达无显著影响（图5j) 或细胞迁移（图 S5E）。这些结果证实 VASH1 通过其微管蛋白去酪氨酸活性介导 miR-143-3p 诱导的 MT 重编程。
m 6 A修饰调控miR-143-3p在肺癌细胞中的表达
研究了导致肺癌和BM 组织中 miR-143-3p 上调的潜在机制。首先，用 5-aza-dC（一种 DNA 甲基转移酶抑制剂）处理对 A549 或 H1975 细胞中的 miR-143-3p 表达没有显著影响（图S6A），表明 DNA 甲基化可能不参与miR-143-3p 在肺癌细胞中的表达。通过用 HDAC1、3、4、6 和 8 的特异性抑制剂或广谱 HDAC 抑制剂（如 SAHA 和 NaB）处理 A549 细胞来研究组蛋白乙酰化在 miR-143-3p 表达中的作用（图S6B）。数据显示，这些HDAC 抑制剂对 A549 细胞中 miR-143-3p 的表达没有显著影响（图S6B）。这些数据表明，DNA 甲基化或组蛋白乙酰化可能不是肺癌细胞中 miR-143-3p 上调的原因。
据报道，N6-甲基腺苷(m6 A) 修饰可以调节 miRNA 的生物发生 。作者发现，敲低哺乳动物细胞中关键的m6 A 甲基转移酶Mettl3 的表达，可以降低 A549 和 H1975 细胞中 miR-143-3p 的表达（图 6a和图 S6C）。作者通过两种siRNA 进一步降低了 A549 细胞中 Mettl3 的表达（图 S6D）。作者的数据显示，Mettl3 的两种 siRNA 也可以显著降低A549 细胞中 miR-143-3p 的表达（图 S6E）。一致地，Mettl3 的过表达可以增加 A549 和 H1975 细胞中 miR-143-3p 的表达（图6b和图 S6F）。有趣的是，sh-Mettl3 显著增加了A549 和 H1975 细胞中前体-miR-143-3p 的表达（图6C）。然而，sh-Mettl3 对 A549 细胞中前体-miR-143-3p 在细胞质和细胞核之间的分布没有影响（图 6d)。此外，sh-Mettl3 对 miR-143-3p 的启动子活性（图 S6G）或初级 miR-143-3p 的表达（图 S6H）没有显著影响，表明m6 A对miR-143-3p的转录没有影响。
sh-Mettl3可以降低mature-miR-143-3p而增加precursor-miR-143-3p的结果表明m 6 A可能调节前体miRNA的剪接。这证实了 sh-Mettl3 对 mature-miR-143-3p 的半衰期没有影响（图 6e) 同时显著增加了miR-143-3p 前体的半衰期（图6f) 在 A549 细胞中。此外，m 6 A RNA 免疫沉淀 (RIP) qPCR 显示与 IgG 相比，m 6 A 抗体水平中前体 miR-143-3p 显著富集，而不是成熟的miR-143-3p（图6G）。为了进一步证实 m 6 A 修饰可以通过加速前体 miRNA 的剪接来触发 miR-143-3p 的产生，作者敲低了Dicer 的表达（图 16h)，将 pre-miRNA 切割成短的单链 miRNA 。作者的数据显示，Dicer 的敲低消除了 Mettl3 诱导的 A549 细胞中 miR-143-3p 的上调（图6i）。结果表明，m6 A可以促进前体miR-143-3p的剪接，从而在肺癌细胞中产生成熟的miRNA。
肺癌的miR-143-3p/VASH轴与体内BM
在这一点上，作者通过使用三个动物队列来明确 m 6 A 甲基化调节的 miR-143-3p/VASH1 轴与肺癌 BM之间是否存在联系。首先，将对照和miR-143-3p稳定的A549细胞皮下注射到裸鼠体内。当每组的肿瘤体积约为 100 mm 3时处死小鼠。IHC 结果显示，与对照组相比，miR-143-3p 可以降低 VASH1 和 deY-tub 的表达，同时增加异种移植物中肿瘤组织微血管密度的生物标志物 CD31 的表达（图 7A）。此外，miR-143-3p的过表达可以增加异种移植肿瘤组织中FN和vim的表达（图7 A）。这表明当肿瘤体积相当时，miR-143-3p的过表达可以增加肺癌体内转移和血管生成的潜力。
为进一步确定miR-143-3p对肺癌体内进展的影响，将对照和miR-143-3p稳定的A549细胞通过尾静脉注射分别注射到BALB/c裸鼠体内以分析肺定植。注射后八周，终止实验并分析肺以报告转移性肿瘤的存在。如图7b-c所示，与对照细胞相比，源自miR-143-3p A549细胞的肺肿瘤数量显著增加，表明miR-143-3p的过表达增加了体内肺癌细胞的肺定植。
为了研究miR-143-3p/VASH1 轴是否可以调节肺癌细胞的体内 BM，A549 对照、miR-143-3p 稳定过表达 (o/e)、VASH1 稳定 o/e 和 miR-143-将 3p/VASH1 双稳定 o/e 细胞注入裸鼠右心室。一只小鼠在心内注射 miR-143-3p o/e 细胞后 1 周死亡，这只小鼠被排除在研究之外。在 A549-Mock 组中，一只小鼠在第 7 周死亡。心内注射后。然而，组织学检查证实该小鼠未发生 BM，因此作者将其纳入最终分析。因此，在第7 周的最终分析时，A549-模拟组中有 8 只小鼠，miR-143-3p o/e 组中有 7 只小鼠。组织病理学分析显示，对照组的 BM 百分比（3/8，37.5%）明显低于 miR-143-3p 组（5/7，71.1%）。BM 在 VASH1 o/e 和 miR-143-3p/VASH1 dual o/e 中的百分比分别为 12.5% (1/8) 和 25.0% (2/8)。这表明 miR-143-3p 诱导的 BM 在 VASH1 的存在下被抑制（图7d 和 e）。这些数据表明 miR-143-3p/VASH1 参与了肺癌的体内 BM。
由于作者的数据显示miR-143-3p 的表达增加表明 OS 减少和 BM 增加，作者进一步质疑VASH1 在肺癌发展中的作用。在来自 Oncomine 的所有分析数据集中观察到癌组织中 VASH1 的表达低于正常组织，包括 Talbot（图 S7A）、Su（图S7B）、Landi（图S7C）和 Selamat（图7f) 肺样本。还观察到从 T1 到 T3 期的肺癌组织中 VASH1 的表达水平显著降低（图7g)，暗示恶性转化过程中VASH1表达呈下降趋势。一致地，观察到肺癌组织从 N0 到 N2 期的 VASH1 表达水平降低（图 S7D）。使用在线生物信息学工具 Kaplan-Meier 绘图仪 （图7h)，作者发现VASH1 表达降低的肺癌患者显示 OS 降低。
作者进一步检查了VASH1 是否参与了作者队列2 肺癌患者的 miR-143-3p 诱导的 BM。IHC检测66例肺癌患者（BM+ 34例，BM- 32例）中VASH1的表达。数据显示，肺癌患者BM+组VASH1的表达明显低于BM-组（图7i）。一致地，miR-143-3p + 组中 VASH1 的表达显著低于miR-143-3p- 组的肺癌患者（图7j）。作者队列中的患者被分为 miR-143-3p - VASH1high 组和 miR-143-3p + VASH1 low组，数据显示 miR-143-3p + VASH1 low 的肺癌患者与miR-143-3p- VASH1 high的患者（图7k）。这些结果表明 miR-143-3p/VASH1 轴触发肺癌的体内进展和 BM。
总之，作者发现与原发性肺癌组织相比，miR-143-3p 在 BM 中的表达增加，并且与肺癌的进展相关。miR-143-3p 可以通过靶向 VASH1 的 3'UTR 的三个结合位点抑制其表达，进而增加体外 BBB 模型的侵袭能力和肺癌细胞的血管生成。从机制上讲，VASH1 可以增加 VEGFA 的泛素化以触发其降解，此外，它还可以通过脱酪氨酸作用赋予微管蛋白解聚作用。m6A甲基转移酶Mettl3 可以通过促进其从前体到成熟 miRNA 的裂解来促进 miR-143-3p 的生成。体内数据证实了 VASH1 在 miR-143-3p 诱导的肺癌 BM 中的重要作用。该研究结果提供一个可以作为转移的预测标志物和肺癌患者抗转移治疗的有效靶点。
