Nat Methods | 高通量绘制T细胞激活序列新方法，快速准确可扩展

原创 huacishu 图灵基因 2022-09-14 10:11 发表于江苏

收录于合集#前沿生物大数据分析

撰文：huacishu

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亮点：

1、作者提出了一种称为BATTLES（用于大规模外源性pMHC筛选的生物力学辅助T细胞触发）的技术，该技术使用生物力学并行启动肽和细胞的T细胞触发；

2、BATTLES可以用来探索基本的T细胞机制生物学和基于T细胞的免疫疗法。

美国斯坦福大学Polly M. Fordyce教授课题组在国际知名期刊Nat Methods在线发表题为“A bead-based method for high-throughput mapping of the sequence- and force-dependence of T cell activation”的论文。适应性免疫依赖于T淋巴细胞，T淋巴细胞利用αβ T细胞受体（TCR）区分主要组织相容性复合物分子（pMHCs）呈现的多肽。识别能够诱导强大T细胞应答的pMHCs不仅能够更深入地理解控制免疫应答的机制，还可以在诊断和治疗中有广泛的应用。

本文中，作者提出了一种称为BATTLES（用于大规模外源性pMHC筛选的生物力学辅助T细胞触发）的技术，该技术使用生物力学并行启动肽和细胞的T细胞触发。BATTLES在由热响应聚合物组成的光谱编码磁珠上显示候选pMHCs，该热响应聚合物能够向T细胞施加剪切载荷，有助于探索T细胞反应的力和序列依赖景观。BATTLES可以用来探索基本的T细胞机制生物学和基于T细胞的免疫疗法。

适应性免疫反应依赖于T细胞敏感地区分非自我和自我的能力，使哺乳动物能够检测病原体感染或恶性转化。在分子水平上，该过程由αβ T细胞受体（TCR）介导，该受体识别抗原呈递细胞（APC）上表达的普遍存在的自身pMHCs中的主要组织相容性复合物分子（pMHCs）呈递的稀有外源肽。抗原pMHC分子的TCR识别触发下游信号事件（例如，Ca2+通量），最终调节T细胞活化，活化阈值由APC1上的抗原pMHC密度调节。预测哪些肽序列将参与和激活特定TCR仍然具有挑战性。

在这里，作者提出了一种BATTES技术，该技术描述了数千个细胞在低密度和存在剪切载荷的情况下与不同pMHC相互作用的T细胞信号反应。为了测试和验证BATTES，作者对T细胞系（TCR589和TCR55）的反应进行了分析，这些T细胞系先前显示结合HIV-pol衍生肽（IPLTEEAEL，HIV-Pols）的反应具有不同的信号反应。超过11000个TCR589和TCR55细胞与21种肽相互作用的测量结果正确地重复了TCR58P的已知反应，并确定了一种替代的合成肽序列（VPLTEDALL），该序列能够在界面上以少至三种TCR–pMHC相互作用刺激TCR5细胞。

通过应用BATTES来系统地改变所呈现肽的施加力和密度的变化率，作者进一步确定，与这种替代合成肽相互作用的TCR55细胞在20–30pN−1时表现出最强的Ca2+反应负载，并且特性随着pMHC密度的增加而降低。最后，对第三种经临床测试的TCR（DMF5）的反应进行了分析。这些模型系统将BATTES确立为一种新技术，适用于更深入地了解TCR触发的结构-活性关系，并在生理力条件下验证新的pMHC抗原。

为了向细胞施加剪切力，将T细胞沉积在含有pMHC的水凝胶珠的表面上，该水凝胶珠由热响应性聚合物组成，使得它们在温度发生微小变化时膨胀（图1a）。为了通过高通量单细胞显微镜监测下游信号反应，用Ca2+敏感染料将T细胞和珠粒涂到微孔阵列中（图1b）。通过将pMHCs与呈现的肽序列和嵌入的光谱代码之间具有1:1关系的光谱编码珠连接，每个实验可以在<5小时内描绘大约1000–3000个细胞与>20个肽序列相互作用的反应。

热响应水凝胶珠向细胞施加剪切载荷

刺激响应性聚合物已用于探测体组织内的机械生物学和单个细胞，包括T细胞。收缩和膨胀的水凝胶微珠可在微珠-细胞界面向pMHC-TCR复合物施加均匀的膨胀力（图1c），施加到单个pMHC-TCMR复合物的载荷取决于形成的复合物的数量及其相对于细胞中心的位置。

温度响应性聚合物（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAm）在临界温度下改变尺寸（图1d），该临界温度可通过添加亲水共聚单体（例如丙烯酸（AAc）或丙烯酸钠（SAc））调节到生理范围，使用微流控液滴产生器生产含有55 mM SAc的单分散NIPAm液滴，然后通过分批UV曝光将这些液滴聚合成固体珠，在室温下产生约23.75 µm半径的珠粒。

为了量化冷却时半径的变化，随后将12个珠子加载到锡氧化物（ITO）载玻片上，并在将温度升高至37°C的同时成像，然后让温度在120 s内冷却至34°C（图1e）。珠子在加热后收缩1.49±0.16 μm，然后在冷却后膨胀0.81±0.06 μm（图1f，g）；60秒后，热响应达到平衡，珠半径保持不变。虽然37至34°C的温度可以改变Ca2+信号的时间，但总累积信号保持不变，这表明Ca2+的信号仅反映对力的响应。

光谱编码珠可以并行测试许多肽

理解肽序列如何支配T细胞信号需要在评估下游反应的同时系统地改变所呈现的序列的能力。光谱编码的微珠允许在单个实验中对多个TCR–pMHC相互作用施加力，作者之前生产的聚（乙二醇）二丙烯酸酯（PEG-DA）水凝胶微珠包含超过1000个不同的光谱条形码（图2a）。为了测试PNIPAm是否与光谱编码兼容，作者制备了含有常量铕（Eu）、镝（Dy）和钐（Sm）的21种组合的羧化PNIPAm珠（图2b）。21个不同的珠Sm/Eu和Dy/Eu比率簇与预期目标比率一致（图2c）。

编码的珠子可以显示生理低密度的肽

接下来，将HLA-B35负载肽文库与这些珠子偶联，该文库包含HIV pol衍生肽（Pol448–456，IPLTEAEL）中的系统突变。这些pMHCs先前已显示在酵母中结合两个TCR（TCR55和TCR589），并驱动激活（图2d，e）。通过紫外线（UV）将感兴趣的肽加载到生物素化pMHC复合物的B35 MHC凹槽中，然后与链霉亲和素包被的珠温育生物素化pMHC复合物（图2f）。所有UV交换和偶联反应都在单独的体积中进行，以将肽序列与嵌入的光谱代码唯一地连接。

为了确保施加到单个pMHC–TCR复合物上的剪切力不会因许多附着点的存在而显著减弱，需要将pMHC复合物以低密度与珠耦合。为了量化界面pMHC密度，用荧光标记的抗β2单克隆抗体孵育珠粒，并通过全内反射荧光显微镜对珠粒-玻璃界面处的珠粒表面进行成像（图2g）。顺应性水凝胶珠沉积在盖玻片表面上，产生直径约50 µm的可观察斑点（图2h），单个抗体标记的界面pMHC显示为分散的荧光点。

配对细胞和珠子探针的力和序列依赖性激活

为了在对pMHC–TCR相互作用施加剪切力时对单个T细胞进行高通量成像，作者制造了一个包含1440个微孔的装置，该装置允许在每个孔内顺序加载单个珠粒，然后在顶部加载一个或多个T细胞（图3a，b）。

在最初的1小时孵育后，让细胞在没有流动的情况下与珠结合的pMHCs相互作用并附着，轻轻冲洗掉未附着的细胞，然后将装置1分钟温度升高至37°C，然后2分钟冷却至34°C；随后通过Cal-520荧光对珠子相关细胞的Ca2+通量进行成像，通过对与每个细胞相关的像素的荧光强度求和，可以直接监测单个T细胞信号。

BATTLES可以识别已知的刺激性激动剂

如果BATTLES能够可靠地识别刺激肽，作者期望看到HIV-pol诱导的TCR589的Ca2+通量。为了测试这一点，对961个TCR58p转导的T细胞与所有21个珠结合的pMHCs相互作用的Ca2+通量进行了定量（图2c）。图像显示所有微孔内的珠的负载（图3b）；在装置加热和冷却期间获得的视频证实，冷却如预期增加了珠半径，并且T细胞始终保持与珠表面接触（图3b）。冷却后，所有肽的力诱导Ca2+通量的荧光图像显示了多种行为（图3c-e）。 

对于TCR589细胞，HIV pol肽（IPLTEEAL）产生了高百分比的“阳性”T细胞反应，“阳性”细胞具有最大的整合强度信号（图3e-g）。Ca2+信号传导的总体动力学和振幅在不同天进行的实验复制之间不同，这可能是由于随着时间的推移整个群体中细胞状态的变化，然而，IPLTEAEL肽始终触发最大比例的细胞并在每个复制实验中产生最高整合Ca2+信号（图3h），确定了BATTLES可以识别能够在体内产生强大细胞毒性反应的肽表位。

BATTLES可以识别新的肽激动剂

接下来，作者测试了BATTLES是否能够识别TCR55转导的T细胞的替代有效激动剂，这些T细胞在没有激活的情况下结合HIV pol（图4a）。与TCR589相反，HIV pol肽IPLTEEAL没有诱导显著的Ca2+反应；相反，突变肽（VPLTEDALL）在两个生物复制中产生最强的功能反应（图4b-d）。

Ca2+信号随施加力的速率而变化

在PNIPAm珠粒基质中加入不同量的SAc改变了相对亲水性/疏水性比率和温度诱导溶胀时半径的变化率（图5a），从而调整最大施加力的变化率。作者聚合了分别含有50、55或60 mM SAc的热响应珠（图5a）。聚合后，所有三种配方的珠粒半径均保持不变，但从37℃到34℃冷却时的半径变化很大（图5c）。

先前使用细胞共培养分析的工作表明，VPLTEDAEL、VPITEDSQL和HIV pol（IPLTEEAEEL）肽驱动TCR55的高、中和不存在的信号反应。这些结果还表明，VPLTEDALL对TCR55转导的T细胞触发最强的Ca2+信号反应，这与先前的肽脉冲APC共培养结果不一致，该结果将VPLTEDAEL确定为最有效的激动剂（图5d）。

多重浓度显示剂量依赖性反应

为了测试信号反应是否取决于呈现的密度，使用相同的四种TCR55结合肽序列（VPLTEDALL、VPITEDSQL、VPLTEDAEL和IPLTEAEL）在三种有效浓度下进行了BATTLES测定。

在1倍浓度下，VPLTEDALL再次驱动最强的下游响应（图5f-h）。对于七倍高的pMHC密度，VPLTEDALL的整合Ca2+信号保持恒定，但与其他三种肽相关的信号增加，表明特异性丧失（图5f-h）。在27倍高的pMHC密度下，与VPLTEDAEL相关的整合Ca2+信号进一步增加，以驱动最强的响应（图5f–h）。这些结果强调了需要在低pMHC密度下进行筛选，以模拟生理机械转导，并在体内识别可能有效的激动剂。

BATTLES可以揭示临床测试的TCR的交叉反应性

最后，将BATTLES应用于临床测试TCR的反应。DMF5识别由I类MHC蛋白呈递的MART-1黑色素瘤抗原，DMF5转导的T细胞与MART-126-35肽负载的树突状细胞相互作用的临床试验证明了肿瘤消退。先前的酵母展示实验揭示了结合DMF5 TCR的两类不同的肽：（1）含有疏水核心序列的MART-1样肽（P4-6中的GIG）和（2）含有高电荷中心核心的肽（P44-6中DRG）（图6a）；然而，目前尚不清楚这两类肽在低密度时是否会驱动类似水平的T细胞活化。

为了评估生理密度下的反应性，对与11种肽相互作用的DMF5 T细胞进行了研究：5种GIG类肽、5种DRG类肽和一种阴性对照肽。与已知作用一致，MART-1锚定修饰的十聚体（ELAGIGILTV）在两个重复中驱动最强的Ca2+反应（图6b-d）。因此，BATTLES可以揭示候选治疗性TCR对不同表位的潜在交叉反应性，即使对于没有显著相似性的基序，也可以提供预测非靶向效应的临床相关信息。

讨论

T细胞在免疫监督和免疫突触形成过程中对APC施加剪切力。TCR-pMHC上的这种物理负载可以通过促进非我和自我之间的区分来提高识别的敏感性和特异性。因此，在体外重述稳健的T细胞活化需要以下能力：（1）显示能够在低密度下驱动TCR触发的肽，（2）施加剪切力以驱动机械转导，以及（3）监测下游T细胞信号。BATTLES平台概括了这些物理化学线索，并可以在<5小时内筛选与数千个细胞相互作用的肽序列。

基于亲和力的筛选方法测定了103-109个不同的序列，促进了对潜在序列空间的深入探索。虽然先前的数据表明，在没有负载的情况下测量的平衡结合亲和力不能准确预测所呈现肽的活化潜力，但已知激动剂肽通常以至少中等亲和力结合TCR。因此，识别新激动剂的有效管道可以从高通量结合筛选开始，然后使用BATTLES有效测试数百到数千个候选“点击”，以确定其在低密度和负载下显示时激活T细胞的潜力。

在未来的工作中，BATTLES可以应用于广泛的其他问题。虽然作者在这里仅测定了21个肽，但基于光谱编码之前已经产生了超过1100个编码，这表明将来可以应用于更大的文库。扩展的肽文库可用于系统地描述TCR或呈现的肽序列的变化如何改变负载下的活化和肽免疫原性。

此外，未来与scRNAseq和scTCRseq相结合可能进一步扩大序列的数量。在医学上，将Ca2+成像与检测活化相关的表面标记物相结合，可以在自体移植前筛选亲和力成熟的TCR或嵌合抗原受体（CAR）T细胞的交叉反应性，从而减少毒性的风险。最后，BATTLES可以作为其他免疫细胞、粘附细胞甚至神经元的通用机械生物学工具。

教授介绍

Polly Fordyce是斯坦福大学遗传学和生物工程助理教授，她的实验室致力于开发和应用新的微流体平台，用于定量、高通量生物物理和生物化学以及单细胞基因组学。她毕业于University of Colorado at Boulder，获得了物理学和生物学本科学位，之后前往Stanford University，获得了物理学博士学位。在她的博士后研究中，她与Joe DeRisi教授合作开发了一种新的微流体平台，用于了解转录因子如何识别和结合其DNA目标。

在她的实验室中，使用微流体和广泛的硬件自动化，通过3个主要平台以前所未有的规模执行研究：1.基于阵列的多路复用实验（MITOMI和HT-MEK）。了解转录因子如何发现并结合其基因组靶点来调节基因表达，以及了解酶如何实现其非凡的催化效率和底物特异性。2.MRBLEs，依赖于光谱来跟踪整个实验中的分析物。可以创建包含超过1000种不同比例的微球，这些微球可以单独通过成像进行唯一识别。3.Dropception是一个微流体平台，用于创建双乳液（油包水）液滴，可以使用标准流式细胞仪进行高通量分选。

参考文献

Feng Y, Zhao X, White AK, Garcia KC, Fordyce PM. A bead-based method for high-throughput mapping of the sequence- and force-dependence of T cell activation. Nat Methods. 2022;10.1038/s41592-022-01592-2. doi:10.1038/s41592-022-01592-2