视频地址：https://www.youtube.com/watch?v=dgzkXLfFAf8&list=PLjiXAZO27elDHGlQwfd06r7coiFtpPkvI&index=3

这一个视频主要是讲数据预处理的过程。主要分成三步：
（1）比对
（2）标记duplicates
（3）碱基质量分数重新校准

我们为什么要进行数据的预处理呢？（用主讲人的话就是：garbage-in和garbage-out的过程）我们拿到的数据受到技术偏差和人为因素的影响，会产生一些duplicates，所以在做突变体calling之前你要对你的数据进行清理。

第一步就是比对。对于DNA测序来说，主讲人推荐使用BWA进行比对。对于RNA测序，推荐使用STAR进行比对：

在比对的过程中，有的reads能很好的识别来源，比如下面的region1和region2。也许会有一些local variants，但是仍然可以分辨出是出自于哪一个区域。但是有些时候，你的样品里会有重复的区域，这种duplicates会使得情况变得复杂。

在大多数的情况下，你的参考基因组是非常特异的，在比对的时候就很容易把reads比对到特异的基因组上。但是如果你的参考基因组本身就有很多重复区域，在比对的时候，软件就会很“困惑”，不知道要把reads比对到哪里去。比如下图中的2A和2B。这时我们就需要双端测序。

因为每一对read的长度是已知的，所以就可以确定到底哪一对read才是真正比对到基因组上的。

比对后生成的文件是SAM文件，以及它的二进制文件BAM文件。这些文件的格式有两部分，一个是头文件，里面是一些信息，比如版本、参考序列、和一些read group的信息；另一部分是record信息，对于每一个read来讲都是唯一的，其中包括read名字，flowcell信息，lane信息，read的方向，比对到正链还是负链，read的位置，比对质量。并且还有mate信息，它告诉你read比对到哪里，以及insert的大小。之后是read的序列，质量分数，最后是metadata，是一些read group的信息。
（这时有人提问，问的问题没有收音进来，只有回答：在一般情况下，在数据前期处理中，你不需要做任何trimming，你可以mark这些接头，之后这些接头会被忽略掉。传统的操作你还会做一些质量trimming，这也是完全没有必要做的，因为variants callers会把碱基质量进行计算，把其作为variant caller的模型。）

下面讲的是关于CIGAR字符。CIGAR字符很好的提供了每一条read的结构信息。下面是个例子：这个CIGAR字符所传递的信息就是1个soft clip，3个比对上的碱基，1个缺失，2个比对上，1个insertion，1个比对上。

对于RNA-seq，就是一个特殊的情况了。因为你的read可能被内含子被分开，如果你用DNA测序比对软件进行比对，你会得到大量的deletions的reads。所以需要另外的比对软件，比如说STAR。

下面讲第二步，标记duplicates。在RNA-seq数据里，你也需要标记这些duplicates。但是一般不选择去除这些duplicates，因为有时你会需要重新进行分析过程，如果直接去除了duplicates，你可能会丢失一些信息。还有在分析不同的批次的数据时，一定要使用相同的比对软件进行处理。

duplicates 的来源主要有两个：一个是文库制备过程中产生的，另一个是测序过程中产生的。

下面简单的说一下软件是如何“决定”是否把一条read标记为duplicate。一般是看一条Read的unclipped的5'端和read的方向（两个方向都会进行比对），并不是把read的全长进行比对来判断的。

下面是两张IGV的截图，分别显示和隐藏了duplicates的reads。软件只是把duplicates进行标记而已，并没有把它们删掉。这也方便让你在IGV里分别查看全部reads和部分reads。

第三步是重新校准碱基质量分数。为什么要做这一步呢？variant calling高度依赖你的数据里碱基质量。但是在测序过程中会存在一些测序仪系统偏差，你需要把这些从你的数据中清理掉。这个软件叫做BQSR，它可以识别测序仪的系统错误，BQSR会使用机器学习产生一个经验错误模型，然后把这个模型应用在样品里所有的reads上，从而对质量分数进行校准。

下面这张图展示的是，在进行重新校准质量分数后，你的比对文件里会出现新的质量分数。主讲人说他们通常把原始的质量分数去掉，来节省储存空间。