今天和大家分享的是2019年6月发表在Neurobiology of Aging（IF：4.398）上的一篇文章，“Identification of age- and gender-associated long noncoding RNAs in the human brain with Alzheimer’s disease”，作者使用GEO数据集对AD相关lncRNA进行表达差异分析，筛选出年龄及性别相关的lncRNA后又分析了与临床分期的相关性，最后进行了通路富集分析。
Identification of age- and gender-associated long noncoding RNAs in the human brain with Alzheimer’s disease
阿尔茨海默病患者大脑年龄及性别相关lncRNA的鉴定
https://www.bilibili.com/video/BV18t4y117uW
一、研究背景
阿尔茨海默病(AD)是一种与年龄及性别相关的脑部疾病。研究表明，长链非编码RNA(lncRNAs)在脑部发育、稳态和脑部病理中起到重要的调节作用。因此，鉴定年龄及性别相关lncRNA在AD患者脑中的差异表达不仅可以为进一步的机制研究提供靶点，还可以为AD患者的个体化治疗提供理论基础。
二、分析流程
limma包：矫正表达数据
GEO2R网页工具：差异分析
KEGG富集分析：网页工具(R2 KEGG pathway: http://r2.amc.nl)
其余：GraphPad Prism
下面给大家推荐2个网页工具，也可以代替上面的R包或GraphPad Prism进行分析：
IDE.91
(http://bioinformatics.sdstate.edu/idep/)
矫正表达数据和差异分析
易汉博
(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html)
可视化的一大利器
三、结果解读
1.衰老大脑和AD患者大脑的lncRNA表达模式
分析正常年轻大脑（≤40岁）和衰老大脑（≥80岁）前额叶皮质的lncRNA表达差异：衰老大脑中22个lncRNA表达上调，22个lncRNA表达下调。
分析正常大脑和AD患者大脑的lncRNA表达差异：AD患者大脑中18个lncRNA表达上调，32个lncRNA表达下调。
正常衰老大脑和AD患者大脑中有15个表达发生变化的lncRNA重合。
重合的15个lncRNA在衰老大脑和AD患者大脑中表达改变模式相同，且LINC01094，NEAT1和LINC00844表达显著上调(Log FC>1)，LINC01007，LINC00507和OIP5-AS1表达显著下调(Log FC<-1)。（如图1）
图1.衰老大脑和正常大脑中重合lncRNA的表达改变模式
2.AD患者大脑中异常表达的年龄相关lncRNA
对年龄和lncRNA log2表达量进行Pearson相关分析：23个lncRNA表达量与年龄呈负相关，29个lncRNA表达量与年龄呈正相关（|r|>0.5,p<0.05）。
对正常大脑和(nd)和AD患者大脑lncRNA的平均log2表达值与年龄进行Pearson相关分析，同时提供95%的预测区间：在nd中与年龄显著相关的16个lncRNA(|r|>0.75,p<0.05)在AD脑部表达发生异常改变。
如年龄正相关lncRNA LINC00844，PRR34-AS1在AD中表达异常上调，年龄负相关lncRNAMIR7-3HG，LINC00643在AD中表达异常下调。（如图2）
图2.年龄相关lncRNA在nd和AD额叶皮质的表达量改变比较
3.AD患者大脑中异常调节的性别相关lncRNA
分析GSE48350数据集的nd和AD样本（如图3A）：正常性别差异lncRNA中，有3个lncRNA在女性AD中差异表达，11个lncRNA在男性AD中差异表达；患者性别差异lncRNA中，有3个lncRNA在女性nd中差异表达，14个lncRNA在男性nd中差异表达。
与nd相比，13个性别相关lncRNA在男性和女性AD中表达均发生了改变（黑点为男性，灰点为女性）。
双向ANOVA分析（性别和AD两个变量）发现性别因素在SLC25A25-AS1和RP11-45P15.4的表达中起重要作用，表明AD对性别相关lncRNA表达的影响依性别不同而不同。（图3B、E）
用CPC和CPAT分析lncRNA的编码潜能，发现AD中表达异常的这16个年龄相关lncRNA和13个性别相关lncRNA均不编码RNA。
图3.性别相关lncRNA在AD患者中表达异常情况
4.年龄及性别相关lncRNA与AD Braak分期及宿主基因的相关性
对GSE48350数据集的lncRNA log2平均表达值和Braak分期进行Pearson相关性分析，研究lncRNA表达与疾病分期的关系：年龄相关lncRNA LINC00672与Braak分期负相关，年龄相关lncRNA SNHG19与Braak分期正相关；性别相关lncRNA RNF144A-AS1，LY86-AS1和LINC00639）与Braak分期负相关。
研究lncRNA表达是否与AD的重要组织病理缺损之一——神经炎性斑块（NP）密度有关，计算年龄及性别相关lncRNA log2表达量和平均NP密度的相关性，发现有4个lncRNA（RP11-223I10.1，LINC01094，OIP5-AS1和LINC01007）与平均NP密度呈中等程度线性相关(|r|>0.3,p<0.05,n=102)。
5.AD患者神经元中的年龄及性别相关lncRNA的调节异常
用含AD患者和正常人额上回神经元基因表达谱的GSE5281数据集，检测lncRNA是否是神经元特异性：发现大多数lncRNA在nd和AD患者中的表达改变模式相同。
年龄负相关lncRNA LY86-AS1，RP11-219A15.5，MIR7-3HG，LINC01007和LINC00643在AD患者神经元中显著下调；年龄正相关lncRNA NEAT1，PRR34-AS1和lnc-BLID-2在AD患者神经元中显著上调。
年龄负相关lncRNA OIP5-AS1在AD患者神经元中显著上调，表明OIP5-AS1在不同的中枢神经系统细胞中改变模式不同，如在AD神经元中上调，在AD神经胶质细胞中下调。
AD相关lncRNA反映可以反映AD早期的氧化损伤和DNA损伤修复(DDR)水平。用GSE66333数据集评估AD相关lncRNA表达与DDR强度的关系发现，AD早期的高水平氧化应激和神经元DDR可以诱发AD相关lncRNA的下调。
6.年龄及性别相关lncRNA的功能分析
用R2 KEGG pathway finder对lncRNA相关基因进行通路富集分析，研究lncRNA在AD大脑中的潜在功能并列举出前30个显著富集的通路。（图4）
年龄及性别相关lncRNA相关基因在AD，HD，PD等神经退行性疾病中均显著富集。
AD的性别及年龄相关基因均在胞吞和前列腺癌通路中显著富集。
正常大脑的lncRNA相关基因在蛋白酶体和长时程增强KEGG通路中均富集。
图4.年龄及性别相关lncRNA相关基因富集通路（示前30个通路）
小结
本篇文章中，作者首先研究了衰老大脑和AD患者大脑的lncRNA表达模式以及AD患者大脑中差异表达的lncRNA，找到了AD中表达异常的18个年龄相关13个性别相关lncRNA。接着，作者分析了lncRNA与Braak分期的相关性。最后对这些lncRNA进行功能分析，结果表明这些lncRNA在许多对AD病理改变的重要信号通路如溶酶体，胞吞作用，突出囊泡循环，轴突指导中起重要作用。
