- 发表时间：2014/4/3
-发表期刊：Plos Computational Biology
背景：
- 微生物分析数据矫正常用方法：相对丰度（百分比）或者所有样本抽样至相同总reads数（rarefaction）
- 两种方法在检测差异物种时，存在较高的假阳性率
- 样本聚类时，较其他方法也不灵敏，可能存在相似度较高的样本不聚在一起的情况
稀疏归一化会影响统计功效
Figure 1
在测试比例（一个 OTU）或比例集（微生物群落）之间的差异时，必须考虑估计每个比例的不确定性。 尽管稀疏化确实使方差相等，但它只是通过以区分能力（增加的不确定性）为代价将所有样本中的方差膨胀到其中最大（最差）的值来实现的。 稀疏还通过随机子采样步骤增加了人为的不确定性。
目的：
找到最优方法结果消除文库大小偏差
结论：
开发metagenomeSeq方法进行微生物数据处理，解决了两个问题
- DNA 测序文库大小差异很大
- OTU（特征）计数比例在泊松模型下的变化大于预期
实验设计：
- 模拟A: 描述性实验的一个简单示例，其中的主要目标是通过归一化来区分整个微生物组样本之间的关系模式，然后计算样本距离。目的是区分样本相似性（beta diversity）
归一化方法：
1.DESeqVS。 DESeq 包中实现的方差稳定化。
2. 原始数据。 计数未转换。 库总大小的差异可能会影响某些距离指标的值。
3. 比例。 计数除以文库总大小。
4. 稀疏。 Rarefying 按照介绍中的定义执行，使用在 phyloseq 包中实现的rarefy_even_depth，抽样大小设置为每个模拟实验中库大小的第 15 个百分位数。
5. UQ-logFC。 在 edgeR 包中实现的 Upper-Quartile Log-Fold Change 归一化。
样本距离：
1. Bray-Curtis
2. Euclidean
3. PoissonDist
4. top-MSD
5. UniFrac-u。无权重UniFrac距离
6. UniFrac-w。有权重UniFrac距离
- 模拟B：模拟 B 是微生物组实验的一个简单示例，其目标是检测两个预先确定的样本类别之间丰度差异的微生物。
归一化方法：
1. 模型矫正（DESeq2或者edgeR）或者原始数据（t检验）
2. 稀疏
3. 比例（相对丰度）
检验方法：
1. two sided Welch t-test
2. edgeR - exactTest
3. DESeq - nbinomTest
4. DESeq2 - nbinomWaldTest
5. metagenomeSeq - fitZig
结果：
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模拟A结果（Figure 4）
Figure 4
- 比例（相对丰度）：使用Bray-Curtis和UniFrac-w距离时，effect size和library size均无太大影响。但是，UniFrac-u有较大影响，准确率低。
- 稀疏：所有距离、effect size、library size，稀疏表现均不佳。对UniFrac-u而言，效果比相对丰度好一些。
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稀疏不同阈值（选择的同等文库大小）对结果的影响（Figure 5）
Figure 5
- 使将阈值设置为模拟中的最小库（没有丢弃样本，所有样本都正确聚类），使用大多数距离方法对最大库大小的样本进行聚类也是微不足道的。
- 对于大多数模拟和归一化/距离，阈值的最佳选择徘徊在库大小的第 15 个百分位附近，但该值不能推广到其他数据。
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模拟B结果（Figure 6）
Figure 6
- 多重 t 检验对此数据表现不佳，无论是稀疏计数还是比例。
- 对应用于原始计数和稀疏计数的更复杂参数方法的性能进行直接比较表明，如果根本不使用稀疏计数，这些方法具有强大的潜力，并且灵敏度和特异性会大大提高。
总结：
稀疏数据的弊端：
- 稀疏计数仅代表原始数据的一小部分，这意味着 II 型错误增加-通常称为功率损失或灵敏度降低。 在样本比较中，这种损失的能力通过两种不同的现象显而易见，(1) 由于被丢弃而无法分类的样本，(2) 由于原始库的丢弃部分而难以区分的样本。
- 稀疏计数相对于泊松模型仍然过度分散，这意味着 I 型错误增加（特异性降低）。 理论上这种性质的计数会过度分散，我们在对公开可用的微生物组计数的调查中明确检测到过度分散。 由于信息丢失，稀疏化后估计过度分散也更加困难。 在我们的模拟中，稀疏计数的 I 类错误比原始计数严重得多。
- 稀疏计数需要任意选择影响下游推理的库大小最小阈值，但对于新的经验数据来说，最佳值是未知的。
- 稀薄化中的随机步骤是不必要的，并且增加了人为的不确定性。
思考：
- 本章探究了稀疏对样本聚类（beta diversity）和差异物种的影响。但是文库大小对alpha diversity影响较大，比较alpha diversity仍可进行稀疏。
- 比较beta diversity，稀疏可能并非最佳方法，相对丰度进行评估可能更佳，但应使用Bray-Curtis和UniFrac-w距离
- 当使用不同归一化方法时，其他因素对microbiome的解释是否会受较大影响？
