文献学习001---Single-Cell Analyses of Colon and Blood Reveal Distinct Immune Cell Signatures of Ulcer...

1.UCa mucosa is characterized by an increased B:T cell ratio

作者对18例non-IBD, 32例UC（14 inactive, i, and 18 active, a）和37例CD（i=25, a=12）消化的肠粘膜组织及24例non-IBD, 27例UC（i=5, a=22）和34例CD（i=12, a=22）外周血进行CyTOF分析。初步结果显示UC Active患者肠粘膜（外周血无显著性差异）相较Non-IBD、UC Inactive、CD Inactive和CD Active患者 T细胞CD3+CD45+比例相对下降，B细胞CD19+CD45+比例相对升高，固有免疫细胞CD3-CD19-CD45+无明显差异，Treg细胞比例相对升高。

联合采用Cytofkit和FlowSOM对T细胞进行t-SNE降维处理，在R中进行层次聚类。可依据CD45RA, CD45RO, CCR7 和CD27的表达情况区分naïve, effector memory [EM], central memory [CM], terminally differentiated EM（CD45RA/TEMRA+）和未分类T细胞。

2.IL-17A++ CD161+ EM T cells are enriched while IFNγ+TNFα+ EM T cell subsets are diminished in UCa mucosa

聚类Marker：IFNγ, CD3, CD8α, CXCR3, HLA-DR, CD38, TNFα, CCR6, CD45RO, CD4, CCR7, CD45RA, CD27, CD44, IL-17A, CD14, IL-21, T-bet, IL-23p19, CD66b, CD11c, CD19, CD16, NKp46, CD123, CD56, CD24, CD163, cKit, IL-1β, IL-22, CTLA-4, Foxp3, CD25, CCR4, CD127, CD161, AHR
IL-17A++TNFα+IFNγ+CD161+DN EM T cells
IFNγ+ TNFα+TEMRA CD8+ T, EM NKT-like cells
以分泌细胞因子定义CD4+, CD8+, CD4+CD8+ (DP) 和 CD4−CD8− (DN) T细胞，发现Node 4(+) DN IL-17A++ CD161+ EM T cell clusters比例在UCa mucosa显著升高。另外DN EM T细胞（CD3+CD4-CD8-CCR7-CD27-CD45RA-CD45RO+）DN CD161+CTLA4+CXCR3+CCR6+TNF-α+IFNγ+IL-17A+, DN CD161+CTLA4+CXCR3+CCR6+TNF-α+ IL-17A+ T即MAIT细胞在UCa患者肠粘膜组织比例升高，然而DN IFNγ+TNFα+ EM T 细胞亚群（TNFα+IFNγ+ CXCR3+IL-1β++, TNFα+IFNγ+CXCR3+CCR6+CTLA-4+IL-1β++）比例相对下降。
通过对5 例UCa患者scRNA-seq进行细胞聚类探讨Node 4(+) DN IL-17A++ CD161+ EM T细胞亚群表达特点。

3.IBD mucosa is characterized by an abundance of HLA-DR+CD38+ T cell populations

对Node 4(-) T细胞亚群分析发现其在IBD患者肠粘膜组织表达明显升高，并以HLA-DR+CD38+为特点。进一步分析发现这一细胞亚群CXCR3, CCR6 and CCR7等趋化因子受体和CD45R异构体CD45RA, CD45RO均表达升高。为了解这一细胞亚群特性，流式圈门此细胞亚群后进行再次聚类（Marker：CXCR3, CCR6, CD45RO, TNFα, IFNγ, CD3, CD38, HLA-DR, IL-17A, CD8α, CD45RA, CCR7, CD27, CD44, CD127, CD4, CD161, CCR4, CD66b, cKit, CD163, CD24, CD123, NKp46, CD16, CD11c, CD19, CD14, CD25, CTLA-4, IL-1β, AHR, Foxp3, IL-22, IL-23p19, T-bet, IL-21），发现HLA-DR+CD38+ T细胞包含CD4, CD8, DN, Treg和记忆等亚群。另外, HLA-DR+CD38+ T细胞co-expressing IFNγ +TNFα+在UCa mucosa表达亦显著减少, 而IL-17A+HLA-DR+CD38+ CD161+ DN EM T cells 相对升高。.IL-1β +HLA-DR+CD38+ T细胞亦表现增加趋势在CDa mucosa。

4.Memory Tregs are increased in abundance in active IBD mucosa and express pro-inflammatory cytokines

流式圈门CD4+CD25+CD127-Treg细胞后再聚类分析（Marker: CD3, IFNG, CXCR3, CD45RO, CTLA-4, HLA-DR, CD38, IL-17A, CD66B, IL1B, IL23p19, CD19, T-bet, CD127, Nkp46, CD16, CD123, CD163, CD11c, CD24, cKit, CD45RA, CCR7, CD14, IL-21, CD8A, IL-22, TNFA, CD27, CD4, CD44, Foxp3, CD25, CCR6, CCR4, AHR, CD161），发现HLA-DR+CD38+ Treg细胞亚群在UCa患者肠粘膜组织中明显升高，趋化因子受体CCR6, CXCR3表达亦相对增加，具备CD25++CTLA-4++CD45RO++记忆细胞活化的独特表型。需注意的是，同样可见到Foxp3++及Foxp3- Treg细胞亚群，Foxp3- Treg具备IFNγ+TNFα+IL-17A+/−促炎表型。可见UCa和CDa患者IFNγ+TNFα+Treg细胞比例相对升高，其中共表达IFNγ, TNFα和IL-17A的Treg细胞亚群相对富集于UCa 肠粘膜组织。外周血Tregs仅IL-1β+CXCR3+ CM亚群在CDa相对升高。考虑新发现IL-1β可表达于Treg细胞，提示Treg在IBD微环境下可能发生功能改变。通过流式验证，相对non-IBD mucosa, IBD患者Treg细胞比例相对升高，而外周血无明显差异。

5.IL-1β+IFNγ+TNFα+ naive B cells are enriched in CDa mucosa

流式圈门CD3-CD45+CD19+B细胞后再聚类分析。
Marker: HLA-DR, CXCR3, CD38, CCR6, TNFA, CCR7, IFNG, CD45RA, CD19, CD44, CD14, CD11c, IL1B, IL-17A, IL-22, CD27, CD3, CD8A, CD66B, CD45RO, CD25, CCR4, AHR, CD24, CD4, IL-21, CD161, IL23p19, Nkp46, CD16, T-bet, CTLA-4, Foxp3, CD123, CD56, CD163, CD127, cKit.
B细胞分成CD27− naïve, CD27+ memory, CD27−CD24+CD38+ transitional 和 CD27+CD24−CD38++ plasmablasts 亚群。IL-1β +IFNγ+TNFα+ naïve B细胞亚群在CDa mucosa表达升高，此亚群以CD44++（B细胞活化标志）、CCR7+, AHR+, HLA-DR+, CD38+ 和 CD11c+（B细胞具有抗原提呈能力标志）为特点。另外，此亚群有分支表达CD14, 提示巨噬/单核细胞或CD14+ B细胞。

6. CXCR3+ plasmablasts are increased in IBD mucosa

B细胞亚群分析发现CXCR3+浆母细胞在IBD mucosa特别是UCa患者中明显增加。此亚群表达Foxp3。

7. UCa mucosa is enriched with unconventional granulocytes and CDa mucosa with IL-1β + dendritic cells

流式圈门CD3−CD19−CD45+ 固有免疫细胞。
再分类：
粒细胞 (CD66b+),
巨噬/单核细胞 (Mφ/mono; CD11c+CD14+),
树突状细胞 (DCs; HLA-DR+CD11c+CD14−),
浆样树突状细胞 (pDCs; CD123+HLA-DR+CD11c+CD14−),
固有淋巴细胞(ILCs)
groups 1 (CD56+Tbet+CD161+IFNγ +TNFα+),
groups 2 (CD161+CD127+CD25++ckit+/−),
groups 3 (CD161+CD127+CCR6++ckit+).
UCa mucosa粒细胞比例相对升高, 而外周血下降。
marker: CXCR3++CD44+CCR4+CCR6+CCR7+CD66b+CD56+.
此亚群表达CXCR3, CCR6, 亦表达非经典粒细胞markers如HLA-DR, CD38和CD56。
CDa 外周血及肠粘膜DCs和pDCs比例相对升高。
DCs marker: HLA-DR+CD11c+IL-1β+TNFα+.
pDCs: HLA-DR++CD123+ CD11c+CD38+CCR7 +.
此亚群均高表达IL-1β。

8. ILC signatures differentiate CD from UC in mucosa and periphery

CDa外周血Group 1 ILCs（含ILC1和NK细胞）比例相对下降，肠粘膜无明显差异。
Marker, HLA-DR+CD38++CD45RA++CD8A+IFNγ++Tbet+CD161+CD56+/-
ILC1及ILC1样细胞亚群（以缺失CD14, CD11c等谱系标志但表达ILC1标志CD8α及细胞因子IFNγ 为特征）在CDa患者外周血比例显著下降，肠粘膜相对升高。
Marker, CD8α+CD14-CD11c-HLA-DR+IFNγ++TNFα+ or CD8α+CD14-CD11c-HLA-DR+IFNγ+ or CD8α+CD14-CD11c-HLA-DR+CD161+CD127+ILC3s亚群在UCa mucosa比例减少。

9. IL-1β+Mφ/mono are increased in active IBD mucosa and in peripheral CDa

CD14+ Mφ/mono在活动性IBD患者肠粘膜比例明显增加且高表达 IL-1β。
scRNA-seq可见UCa患者某髓系细胞亚群高表达IL1B, CD14, FCGR3A, IL8, S100A8/A9 (calprotectin), CD163, SOD2, 和LYZ。

RF modeling discriminates CDa vs UCa in mucosa and periphery
RF模型可通过外周血或肠粘膜组织有效区分CDa和UCa患者。
有趣的是肠粘膜组织区分细胞亚群以淋系为主，如HLA-DR+CD38+ T cells and IL-17A+ CD161+ DN EM T cells, CXCR3+ plasmablasts, ILC1/IL2/ILC3.
外周血区分细胞亚群以髓系为主，如IL-1β+ Mφ/mono/DCs。