这篇文章于2023年2月发表于Nature Cell Biology（IF=28，Stiff matrix induces exosome secretion to promote tumour growth）,是一篇探讨肿瘤细胞微环境对肿瘤细胞外泌体分泌影响及其分子机制的文章，做相关方向机制没有思路的同学可以借鉴一下。

研究意义：组织纤维化和随之产生的胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的变硬和肝细胞癌、胰腺导管腺癌和乳腺癌等多种肿瘤进展有关。已知变硬的ECM可促进细胞增殖、上皮间质转化、迁移和化学耐药，这与胞外基质变硬导致的细胞所受张力增加有关。具体机制则与细胞膜中的整合素蛋白（Integrins）感应ECM硬度，进而通过调节细胞黏附分子将信号传到至胞内，促进肌动蛋白等骨架蛋白的重构和相应信号通路的激活。虽然ECM硬度调控胞内信号通路相关机制已得到了广泛研究【1】（图1），但基质硬度如何影响肿瘤微环境和细胞间相互作用，从而促进肿瘤进展仍是未解之谜。外泌体（直径40-160nm）是细胞分泌的胞外囊泡，通过携带的蛋白和小RNA等分子影响细胞功能，其具体形成过程见图2【2】（图2）。小GTP酶Rab家族成员是调节外泌体合成和分泌的主要调控因子。研究表明，外泌体可以通过影响肿瘤微环境促进肿瘤迁移进展，但基质产生的致癌信号是通过何种机制调控外泌体分泌仍是未知。

图1

图2

研究策略：为研究细胞外基质硬度对细胞外泌体分泌的影响及其可能机制，作者首先构建了不同硬度基质培养肿瘤细胞的模型，然后检测其对细胞外泌体分泌的影响。为找到调控该过程的重要信号通路，作者用定量蛋白组学进行了筛选，然后作者对筛选到的相关通路蛋白进行了功能验证和深层机制解析。

研究方法：

1、Matrix stiffening promotes exosome secretion （确定基质硬度是否与外泌体分泌有关）

为了证实基质硬度对外泌体分泌的影响，作者探究了不同基质硬度是否影响肝癌细胞Huh7外泌体的分泌。结果表明，高硬度基质培养的细胞分泌的外泌体数量和外泌体总蛋白更多（图3 A-D）。除此之外，作者还在原代肝癌细胞、乳腺癌细胞系和胰腺癌细胞系进行了验证，结果与Huh7一致（图3 E-G）。由此，作者得出第一个重要结论：ECM的硬度与癌细胞外泌体分泌呈正相关。

图3

2、Akt promotes exosome secretion from cells grown on stiff matrix（找到基质硬度影响外泌体分泌的相关信号通路）

为了找到基质硬度调控细胞外泌体分泌的相关信号通路，作者用定量蛋白组学对不同硬度培养环境Huh7细胞的蛋白谱改变进行了检测。结果显示，S473 Akt及其下游S65 4E-BP1和S9S21 GSK-3的磷酸化显著增加（图4A-B）（同时，作者还发现Notch信号通路激活，这在后面第5部分会讲到）。接下来，作者直接在细胞中过表达持续激活的Akt，结果显示，细胞外泌体的分泌显著增加（图4C）。相反，Akt抑制剂MK2206能显著抑制外泌体的分泌（图4D-E）。考虑到FAK磷酸化对基质硬度引起的基质张力和Akt激活增加，作者用FAK抑制剂PND1168进行了干预【3,4】。结果显示，PND1168显著抑制了高硬度基质培养细胞的Akt磷酸化和外泌体分泌（图4F-G）。由此，作者找到了基质硬度调控Akt磷酸化的信号通路，接下来就是找到Akt磷酸化与外泌体分泌的相关信号通路的探究。

图4

3、Matrix stiffening leads to Rab8 activation that regulates exosome secretion（继续探究Akt磷酸化调控外泌体分泌的具体信号通路）

为了找到Akt调控外泌体分泌的具体通路，作者把研究重点集中在囊泡运输主要调控蛋白小GTP酶Rab家族上。具体而言，作者探究了Akt激活对囊泡的胞外运输至关重要的Rab27和Rab8影响。结果显示，高硬度基质培养的细胞其GTP-Rab8与经典下游效应蛋白JFC1结合增加，而同为JFC1上游的GTP-Rab27，其与JFC1的相互作用没有显著改变（图5A）。而MK2206处理降低GTP-Rab8水平也表明，高硬度基质条件下的Rab8可以被Akt激活（图5B）。接下来，为了证明Rab8在高硬度基质条件下细胞外泌体分泌中的作用，作者在Hub7细胞内过表达Rab8。结果显示，Rab8过表达促进了外泌体分泌，而MK2206则可以抑制该效应（图5C-D）。相反，敲低Rab8则可以抑制外泌体分泌，且添加MK2206无显著的抑制效应（图5E-F）。由此，作者找到了基质硬度调控Akt激活的直接下游Rab8。那么，Akt是如何调控Rab8的激活的呢？

图5

4、Rabin8 is phosphorylated and activated by Akt（Akt调控Rab8活性的机制）

Rab8的GTP化和激活需要Rabin8的调控，而Rabin8的敲低能显著抑制高硬度基质培养细胞的外泌体分泌（图6A-B）。接下来，作者对Rabin8进行了序列分析和质谱鉴定，发现了“142LSRLRSPS*VLEVREK156”这段磷酸化序列，该序列保守型较高，并与Akt磷酸化底物基序“RxrXXS/T”相匹配。研究发现，上述丝氨酸位点的磷酸化（Serine149）在过表达持续激活Akt的细胞中显著增加，而突变为丙氨酸后，该磷酸化现象消失（图6C）。进一步在高硬度基质培养细胞内发现，Rabin8的上述磷酸化显著增加，且MK2206处理能显著下调其磷酸化（图6D）。由此得出，高基质硬度能够促进Akt对Rabin8的磷酸化激活。作者还进一步探讨了Rabin8磷酸化激活Rab8的机制。结果显示，该位点磷酸化能够显著促进Rab8与GDP的结合速率，反之则抑制二者结合速率，表明Akt对Rabin8的磷酸化增强了Rabin8的GTP结合速率（图6E-F）。由于Rabin8存在自我抑制构象，作者进一步用BRET（Bioluminescence resonance energy transfer）实验对其进行了验证。结果显示，BRET比例在Akt磷酸化后显著下调，表明Akt抑制Rabin8的自我抑制构象的形成。由此，作者阐明了高硬度基质培养条件下，Akt激活通过调控Rabin8的磷酸化，抑制其自我抑制构象的形成，从而增强其对Rab8的激活作用。

图6

5、Exostiff promotes tumour aggression through Notch pathway activation

由上述研究作者发现高硬度基质培养的细胞外泌体通过FAK-Akt-Rabin8信号轴调控外泌体分泌，那么分泌的这些外泌体是否也有与之前报道一致的促肿瘤进展功能呢【5】？为此，作者用C57小鼠构建了肝癌模型，并将不同硬度基质培养细胞分泌的外泌体注入肝癌小鼠。结果表明，高硬度基质培养细胞分泌的外泌体显著促进了肝癌进展（图7A-B）。相反，用Akt抑制剂MK2206处理高硬度基质培养细胞所分泌的外泌体不能促进肝癌进展（图7C）。那么外泌体是如何促进肝癌进展的呢？这就需要提到蛋白组学筛选到的另一个明显改变的通路--Notch signaling了。

Western blotting 的结果表明，高硬度基质培养细胞Notch信号通路组分蛋白显著增加（图7D）。已知Notch信号通路与肝癌进展有关【6】，作者也对二者相关性进行了验证和确认（图7E-F），而在Huh7细胞内的研究发现，高硬度基质培养细胞分泌的外泌体能上调细胞Notch信号通路组分蛋白（图7G）。已知Notch信号通路可以通过影响肿瘤微环境促进肿瘤进展，而且Notch信号通路的激活配体Jagged1存在于外泌体【7,8】。进一步检测发现，高硬度基质培养细胞分泌的外泌体含有更高水平的Jagged1（图7H）。免疫荧光检测结果显示，Jagged1与此类细胞分泌的外泌体标志蛋白CD63和HRS（介导外泌体内容物向多囊泡运输）存在共定位（图7I）。免疫共沉淀的结果也显示了Jagged1和HRS的相互作用（图7J）。上述结果表明，外泌体可能通过增加Notch信号通路激活配体Jagged1的运输激活肿瘤细胞的Notch信号通路，从而促进肿瘤进展。

图7

Take-home messages：

总结一下，故事的大概思路就是确定肿瘤生长微环境硬度与肿瘤细胞外泌体之间的关系→蛋白组学高通量筛选到显著改变蛋白→基质硬度调控目的蛋白及目的蛋白调控外泌体分泌具体的分子机制，以及外泌体调控肿瘤进展的可能机制探讨。研究结论回答了研究意义中“基质硬度如何调控肿瘤微环境-肿瘤细胞相互作用，以及该刺激如何调控外泌体分泌”的问题，但是外泌体调控肿瘤进展的具体机制论证则相对不足（第5部分的后半部分），只是进行表达相关性的分析，并没有对应抑制/激活相关信号通路的功能验证，可能这也是作者Notch信号通路部分机制探索用词比较收敛的原因。

这篇故事对我们的启示：（1）故事的种子一定要好（基质硬度如何通过外泌体介导肿瘤细胞和其微环境间的相互作用及其具体分子机制）；（2）做一个课题一定要有一套成熟的细胞/动物模型（外泌体分析模型，这是你在领域内的话语权）。上述两点对于投较好期刊（或者说过编辑这关）是非常重要的。其次，分子机制的探索仍是优秀期刊必不可少甚至是最重要的，表型的描述固然重要，但一个故事更重要的是表型下面潜在的分子机制，即知其然更要知其所以然（虽然本文Notch部分阐述不是特别具有说服力，但Akt部分论证是十分具有说服力和翔实的）。至于如何找到有意思的分子机制，可以通过文献和组学技术找已知分子的新下游/新修饰位点，或者利用高通量筛选找已知/未知的分子。不要拘泥于一个分子的已有研究报导（例如本文的Akt蛋白），我们应该意识到：机制是张信号通路网，我们找到的某一个分子只是这张网的一个节点而已，而不同的细胞、不同的上游刺激都会改变这张网的布局，能用巧妙的实验和意外的发现让我们能一窥这张网的“冰山一角”，并让跟进者能“顺藤摸瓜”才是科研的意义和乐趣所在。

【参考文献】

1. Miranti, C. K. et al. Sensing the environment: a historical perspective on integrin signal transduction. Nat Cell Biol 4, E83, doi:10.1038/ncb0402-e83 (2002).

2. Colombo, M. et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol 30, 255, doi:10.1146/annurev-cellbio-101512-122326 (2014).

3. Levental, K. R. et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell 139, 891, doi:10.1016/j.cell.2009.10.027 (2009).

4. Wang, H. B. et al. Focal adhesion kinase is involved in mechanosensing during fibroblast migration. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 11295, doi:10.1073/pnas.201201198 (2001).

5. Kalluri, R. et al. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science 367, doi:10.1126/science.aau6977 (2020).

6. Villanueva, A. et al. Notch signaling is activated in human hepatocellular carcinoma and induces tumor formation in mice. Gastroenterology 143, 1660, doi:10.1053/j.gastro.2012.09.002 (2012).

7. Gonzalez-King, H. et al. Hypoxia Inducible Factor-1alpha Potentiates Jagged 1-Mediated Angiogenesis by Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes. Stem Cells 35, 1747, doi:10.1002/stem.2618 (2017).

8. Meurette, O. et al. Notch Signaling in the Tumor Microenvironment. Cancer Cell 34, 536, doi:10.1016/j.ccell.2018.07.009 (2018).