双荧光素酶应用实例（一）

1、验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测基因的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，检测荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。

2、验证microRNA同lncRNA靶向互作。将待测lncRNA序列插入报告基因载体的3’UTR区域，检测荧光素酶活性。

3、启动子结构分析。将启动子区域(约2k左右)进行分段截短或突变，构建入报告基因载体，检测荧光素酶活性。

4、启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。

5、验证信号通路是否激活。将该信号通路的下游相应原件序列构建入报告基因载体，检测不同上游条件下，其荧光素酶活性，即下游信号通路的响应情况。

例子1

构建pGreenH0800-PuGSTU17-LUC和pGreenI0800-PuPLA2-LUC载体

烟草瞬时激活实验验证PuHSFA4a对下游基因PuGSTUI7和PuPLA2的瞬时激活

LUC酶活测定实验表明: PuHSFA4a能够激活PuGSTU17和PuPLA2的启动子导致

这两个基因的转录表达。参考东北林业大学博士论文。2019-03

例子2

黄瓜原生质体瞬时表达检测下游基因启动子活力

为了明确CsATAF1对下游基因的激活或抑制作用，利用烟草叶片注射和黄瓜原生质体瞬时转化实验，对下游基因的激活进行检测，结果表明，CsATAF1激活了CsDREB2C, CsCu-ZnSOD， CsABI5的表达，促进了下游报告基因的表达。

例子3：

转录激活实验

完整的ALMTI启动子(P1) 和5'端缺失的启动子(P2)被克隆后构建到报告载体中(如图5-11b), 分别与35S启动子带动的WRKY46一起侵染烟草叶片。结果显示，WRKY46明显抑制由完整ALMTI启动子(P1) 带动的荧光素酶的活性，但不影响5'端缺失的启动子(P2) 带动的荧光素酶活性，说明缺失的启动子序列(含6个W-box 元件)对WRKY46与ALMTI启动子的相互作用至关重要。

例子4

例子5---启动子结构分析。将启动子区域(约2k左右)进行分段截短或突变，构建入报告基因载体，检测荧光素酶活性。

苹果U6启动子的克隆及功能分析

本试验以pYLsgRNA-At U6-1质粒为模板克隆长度为301 bp的At U6-1启动子（表1），并连接至p GreenII-0800-LUC载体，命名为At U6-1P::LUC。不同U6启动子驱动荧光素酶基因的融合表达载体示意图如图

U6启动子驱动LUC报告基因的融合表达载体构建

详细实验结果参考：苹果U6启动子的克隆及功能分析 - 中国知网

例子6

然后分别取材按照双荧光素酶试剂盒试验步骤测量不同样品中LUC及REN的荧光值并计算每种样品中LUC/REN比值。结果发现a组与b组荧光比值都很低，说明试验操作及烟草生长状态良好。而d组相对于c组比值下降了3.5 倍左右，说明转录因子AtMYB32抑制AtGA20oxl的表达(图2.6B)。通过分析过表达株系中AtGA20ox1基因的表达，发现过表达株系中AtGA20ox1基因的表达相对于野生型来说均有不同程度的下降，进一步验证了转录因子AtMYB32对AtGA20oxl的抑制作用(图2.6C)。