&Relationship between oxidative stress and apoptotic markers in lymphocytes of diabetic patients with chronic non healing wound

糖尿病慢性伤口非愈合患者氧化应激与细胞凋亡标志物的关系

摘要：

目的：高血糖症会导致自由基的产生，从而导致各种细胞的氧化应激和细胞凋亡。本研究旨在探讨慢性非愈合性糖尿病患者糖尿病患者淋巴细胞氧化应激与凋亡标志物的相关性。

方法：本研究包括30例健康，30例不受控制的2型糖尿病（T2DM）和30例非控制性T2DM伴有慢性，非治愈性神经性糖尿病足的患者。通过测量超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶，谷胱甘肽和丙二醛（MDA）的含量来估算淋巴细胞裂解液内部的氧化应激指标。进行了前凋亡标记和抗凋亡标记的蛋白质表达研究，以阐明它们可能与糖尿病有关。

结果：与健康人相比，患有慢性非愈合性糖尿病伤口的糖尿病患者的淋巴细胞中SOD和MDA活性显着更高（p <0.001）；而同一组中过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显着降低（p <0.001）。在糖尿病和非糖尿病个体的淋巴细胞中，促凋亡标记物（Caspase-3，Fas和Bax）的表达明显较高，而抗凋亡标记物（Bcl-2）的表达降低。

结论：高血糖赋予凋亡的表现，主要是通过改变淋巴细胞环境中的氧化应激指数来实现的。

1.简介

糖尿病（DM）是一组代谢性疾病；由于胰岛素分泌或胰岛素作用缺陷，或两者兼而有之，会导致高血糖水平发生。长时间的高血糖症会导致糖尿病的各种并发症，与各种器官的损伤、功能障碍和衰竭有关，尤其是眼睛、肾脏、神经、心脏和血管[1]。糖尿病正在引起全世界范围内日益普遍的公共卫生问题，以及广泛的代谢、免疫和激素异常。根据国际糖尿病联合会（IDF）的数据，2010年全球约有2.85亿人（年龄在20-79岁之间的人群中有6.6％）患有糖尿病。发展中国家患糖尿病的风险更高，这从糖尿病病例的发生率上升中可以明显看出[ 2]。

有大量证据表明，高血糖是细胞内活性氧种类（ROS）产生增加导致微血管和大血管并发症的主要原因[3]。 ROS在各种细胞（包括从糖尿病个体获得的淋巴细胞）中的蓄积清楚地表明其产生是由于蛋白质氧化损伤（蛋白质羰基形成的增加）和膜脂质过氧化作用的升高。在胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）和非胰岛素依赖型糖尿病（NIDDM）中，脂质过氧化和蛋白质氧化的增加都得到了明确的确认[4]。除糖尿病外，脂质过氧化通常在与糖尿病相关的并发症如神经病、肾病或视网膜病中升高。脂质过氧化是膜损伤的直接指标，因此在糖尿病患者的情况下表示细胞环境中的毒性表现[5]。

谷胱甘肽是一种主要的抗氧化剂，可作为直接的自由基清除剂。高血糖期间产生的过氧化氢通过还原型谷胱甘肽作为氢供体被谷胱甘肽过氧化物酶代谢成水[6]。过氧化氢酶是一种主要的抗氧化酶，位于过氧化物酶体中，可将过氧化氢分解为水和氧气。

SOD通过将超氧化物自由基转化为过氧化氢和分子氧来清除自由基；通过这种方式，它减少了由于细胞内自由基而产生的毒性作用。据报道，在血管功能障碍中，SOD的增加可减轻微血管和大血管糖尿病的并发症[7]。

在细胞死亡的过程中，ROS起着双重作用：首先，作为诱导期的信号，其次，是线粒体通透性转变导致最终细胞破坏的常见结果。氧化应激刺激细胞在几种免疫相关疾病中发生凋亡，最近有研究表明，糖尿病患者淋巴细胞的氧化状态与细胞凋亡之间存在联系[8]。

淋巴细胞凋亡在维持适当的免疫功能中起重要作用[9]。细胞凋亡是一个非常复杂的过程。它可以通过两种不同但相互联系的途径引发：内在（线粒体依赖性）和外在（受体诱导）途径。该途径的关键调控因子是Fas，Caspases和Bcl-2基因家族成员。 Bcl-2和Bax蛋白是具有细胞内膜结合蛋白，具有拮抗作用，其中Bcl-2延长细胞存活，Bax促进细胞凋亡后引起细胞死亡[10]。 Bcl-2通过增加细胞内内源性抗氧化剂（例如，谷胱甘肽或SOD）的水平或活性间接充当抗氧化剂[11]。几项研究表明细胞内ROS和Bcl-2水平之间存在相互关系。大量的ROS会导致脂质过氧化，破坏细胞膜，使Caspase酶失活以及坏死性细胞死亡[12]。

细胞中更多的活性氧（ROS）积累通过增加Caspase-3活性和抑制Bcl-2表达来开启细胞凋亡过程[13]。 Caspase-3是细胞凋亡的关键执行者，因为它完全或部分负责许多关键蛋白（如核酶聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP））的蛋白水解切割[14]。可以通过测量Caspase-3表达来详细研究凋亡机制。胱天蛋白酶的活化与Fas受体介导的活化淋巴细胞的凋亡有关。当Fas受体与其配体结合时，靶细胞会发生凋亡[15]。 Fas / Fas-L系统在诱导和调节淋巴细胞中程序性细胞死亡[16]和血管壁细胞成分[17]中起主要作用。 Fas系统衰竭会导致淋巴增生性疾病并加速自身免疫性疾病，而其过度活动可能会导致组织破坏。

随着抗氧化剂的增加和减少，抗氧化剂防御机制的状态存在非常矛盾的证据[18]。 本研究旨在发现患有或未患有慢性非愈合性伤口的失控糖尿病患者的淋巴细胞中氧化应激标志物与凋亡介导蛋白之间的相关性。

2. 材料和方法

2.1 用料

磷酸氢二钠，5,50-二硫代双-（2-硝基苯甲酸）（DTNB），冰醋酸，谷胱甘肽还原（GSH），烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原形式（NADH），重铬酸钾，磷酸二氢钠和三氯乙酸（TCA） ）是从印度Sisco Research Laboratories（SRL）购买的。 Folin Ciocalteau试剂，过氧化氢（H2O2），硝基蓝四唑（NBT），吩嗪硫酸甲酯（PMS）和重铬酸钾购自德国默克公司。十二烷基硫酸钠（SDS），焦磷酸钠，硫代巴比妥酸（TBA）购自美国Sigma–Aldrich。 Ficoll-paqueTM plus购自GE医疗保健。多克隆兔抗Bax抗体，兔抗Bcl2抗体，兔抗Caspase 3抗体，兔抗Fas抗体，小鼠单克隆抗bactin抗体，牛抗小鼠碱性磷酸酶（AP）结合和山羊抗兔IgG–AP购自美国Santacruz Biotechnology。 BCIP / NBT从印度的班加罗尔Genei采购。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自Millipore India Pvt。有限公司

2.2 科目

这项研究是在印度瓦拉纳西Banaras印度大学的医学研究所Sunderlal爵士医院进行的。根据世界医学协会（WMA）制定的关于良好临床实践的赫尔辛基宣言，所有参与者均纳入了研究。机构伦理委员会批准了这项研究，并从每个参与者处获得了书面知情同意书。本研究包括90个患者，包括以下几组：

DC组（n = 30）：患有不受控制的T2DM伴有慢性非愈合性伤口的患者。

D组（n = 30）：患有不受控制的T2DM且无慢性非愈合性伤口的患者。

H组（n = 30）：健康受试者，无糖尿病或伤口。

根据美国糖尿病协会（ADA）的标准，即两次空腹血糖水平（126 mg / dl，即7.0 mmol / l）或口服葡萄糖耐量试验（OGTT）产生200 mg的糖尿病，被诊断为糖尿病2小时后/ dl（11.1 mmol / l），或无控制的糖尿病症状，随机血糖水平为200 mg / dl（11.1 mmol / l）。研究入选标准包括糖尿病控制不佳{糖基化血红蛋白（HbA1C％）8.0}。

参与这项研究的患者均接受了详细的临床病史和体格检查。 这包括年龄、性别、糖尿病持续时间，暗示糖尿病的症状和糖尿病家族史。 身体检查包括人体测量，例如身高、体重、体重指数和腰围。 还对受试者的基线研究参数进行了调查（表1）

2.3 人淋巴细胞的分离

通过静脉穿刺法收集人体血液样品，并将其置于含有肝素作为抗凝剂的真空/硅化试管中。血样在磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释，并使用Boyum法[19]使用Ficoll-paqueTM plus梯度分离淋巴细胞。通过台盼蓝染料排斥试验确定活细胞的数目（＞ 95％）。

2.4 实验室评估

血浆葡萄糖水平[空腹血糖（FBG），餐后血糖（PPBG）]通过葡萄糖氧化酶/葡萄糖过氧化物酶法通过商业试剂盒根据制造说明书（Span diagnostics，印度）来估计。使用制造商的方案，在医院的中央实验室Synchron CX-5自动分析仪（美国贝克曼库尔特）上分析血浆脂质参数。脂质参数包括总胆固醇（TC），高密度脂蛋白（HDL），低密度脂蛋白（LDL），极低密度脂蛋白（VLDL）和甘油三酸酯（TG）。

2.5 氧化应激指数

2.5.1 超氧化物歧化酶（SOD）

通过Nishikimi等人的改进方法测定SOD活性。 [20]。简而言之，将含有焦磷酸钠缓冲液（pH 8.3，0.052 M），吩嗪硫酸甲酯（186 mM），硝基蓝四唑（300 mM），烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠还原盐（NADH; 780 mM）和细胞裂解液的测定混合物进行孵育在30 8 C下加热90 s，然后加入冰醋酸和正丁醇。在560 nm处读取正丁醇层的吸光度。结果表示为单位/ ml / min。抑制NBT减少50％所需的SOD量被认为是一个SOD单位。

2.5.2 过氧化氢酶估计

淋巴细胞中的过氧化氢酶活性是根据Sinha [21]描述的方法估算的。将含有0.01M磷酸盐缓冲液（pH 7.0），0.2M过氧化氢和0.1ml适当稀释的细胞裂解物的最终测定混合物在37℃下孵育1分钟。通过加入包含重铬酸钾和冰醋酸（1∶3）的混合物来终止反应。然后将样品在沸水浴中温育15分钟，冷却，并在缺少过氧化氢的对照下于570nm读取吸光度。

酶活性以毫摩尔/分钟/毫克蛋白质计算。

2.5.3 减少的谷胱甘肽（GSH）估算

根据Boyne和Ellman [22]所描述的方法，估计谷胱甘肽活性降低，但几乎没有修改。 GSH与DTNB反应，DTNB是一种二硫化物色原，很容易被它还原成在412 nm测得的深黄色化合物。简而言之，将细胞裂解物与偏磷酸混合，然后以5000 rpm离心10分钟。在上清液中加入0.4 M Na2HPO4和DTNB试剂，生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸酯-SH。在2–5分钟内在412 nm处读取吸光度。

2.5.4 脂质过氧化（LPO）估算

丙二醛（MDA）与TBA形成加合物，可使用分光光度计测量。对于脂质过氧化分析，我们使用了Ohkawa等人描述的方法。[23]。简而言之，将淋巴细胞裂解液（1 107个细胞）与8％SDS溶液混合，并在室温下孵育5分钟。将冰醋酸（20％）添加到反应混合物中，并在室温下孵育2–5分钟。最后，将0.8％TBA溶液加入反应混合物中，然后在沸水浴中温育1小时。将反应混合物冷却，离心，并在没有溶解物的情况下同时显影对照，在532nm读取上清液的吸光度。LPO水平表示为nmoles MDA / 1 * 10 7细胞。

2.6 蛋白质估算

使用Lowry等人的方法，从对照和患者分离的淋巴细胞的裂解物中估计蛋白质含量。 [24]方法。对照牛血清白蛋白（BSA）的标准曲线计算蛋白质浓度（mg / ml）。

2.7 蛋白质印迹分析

使用Western blotting [25]，对糖尿病患者和健康组的外周血淋巴细胞中的Caspase-3，Fas，Bcl-2和Bax蛋白的表达进行了分析[25]。简而言之，将变性的蛋白质在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并电印迹在PVDF膜上。将印迹用含有0.25％Tween-20（TBS-T）和3％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水封闭过夜，以阻断非特异性结合，然后与抗Caspase-3的一抗（1：2000），Fas（ 1：2000），Bcl-2（1：2000）和Bax（1：5000）在4 8C下过夜。使用TBS-T缓冲液中的碱性磷酸酶（AP）偶联的山羊抗兔二抗分别检测Caspase-3，Fas，Bcl-2和Bax。使用BCIP / NBT作为底物可视化印迹。以b-肌动蛋白为参照计算相对条带密度，数据表示为至少五个实验的条带密度比的平均标准偏差（SD）。

2.8 统计分析

结果表示为不同组的平均标准偏差（SD）。使用Graph Pad Prism5软件通过单向方差分析（ANOVA）评估统计显着性。 Newman–Keuls后测用于多个比较。当p值小于0.05时，差异被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1  生化参数

三组的平均FBG，PPBG，HbA1c，TC，TG，LDL，HDL和VLDL之间存在显着差异（p <0.001）。 但是，所有三组的体重指数（BMI）均无显着差异（表1）。

3.2  氧化应激参数

3.2.1  超氧化物歧化酶

在D组和DC之间观察到SOD活性显着增加（p <0.001）。 与H和D组相比，DC组表现出更明显的增加（p <0.001）（图1A）。

3.2.2  过氧化氢酶

与健康组个体相比，两组糖尿病患者淋巴细胞中的过氧化氢酶活性均显着降低（p <0.001），因为与D组相比，DC中过氧化氢酶活性没有明显降低（图1B）。

3.2.3 还原型谷胱甘肽（GSH）

D组和DC组的淋巴细胞中的谷胱甘肽含量明显低于H组（p <0.001），而D组和DC组之间的显着性值为p <0.05（图1C）。

3.2.4 脂质过氧化（LPO）

与H组相比，观察到DC淋巴细胞的脂质过氧化显着增加（p <0.001）。与DC组和D组相比，显着性水平为p <0.001（p <0.001）（图1D）。

3.3 蛋白质印迹分析

Fas的蛋白质印迹分析显示，与H组相比，D组和DC组的蛋白表达显着增加（p <0.001）。 DC组中Fas蛋白表达的变化与D组相比有显着性差异（p <0.01）（图2A）。在糖尿病患者中观察到Caspase-3蛋白表达的显着增加。与D组和H组相比，DC组在Caspase-3表达上有统计学意义的增加（p <0.001）（图2B）。与H组相比，Bcl-2的Western印迹显示D组和DC组蛋白表达显着减弱（p <0.001）。与D组相比，DC组的Bcl2表达明显下降（p <0.01）（图2C）。与H组相比，D组和DC中Bax蛋白水平的增强非常显着（p <0.001），而与D组相比，DC组中Bx蛋白水平的显着性水平为p <0.05（图2D）。

图1 –（A）健康，不受控制的糖尿病和患有慢性非愈合伤口的个体的不受控制的糖尿病患者淋巴细胞中SOD活性的变化。 数据表示为平均W SD（每组n = 30）。 （B）H，D和DC组淋巴细胞的过氧化氢酶活性。 （C）健康，不受控制的糖尿病和患有慢性无法治愈的伤口的糖尿病患者的淋巴细胞中的GSH含量（D）有糖尿病和无慢性无法治愈的伤口的健康与不受控制的糖尿病患者的淋巴细胞脂质过氧化的变化（*** p <0.001， 与健康相比，** p <0.01；### p <0.001和#p <0.05，与无并发症的不受控制的糖尿病和具有慢性非愈合性伤口的不受控制的糖尿病相比。 每个面板中的第一，第二和第三栏分别代表健康，不受控制的糖尿病和患有慢性非愈合性伤口的不受控制的糖尿病。

图2 –健康，不受控制的糖尿病和患有慢性非愈合性伤口的不受控制的糖尿病患者淋巴细胞中Caspase-3，Fas，Bcl-2和Bax蛋白的蛋白质印迹分析。 （A）上图描绘了代表性的印迹，显示了Fas蛋白在健康，无法控制的糖尿病和患有慢性非治愈性伤口的未控制糖尿病中的表达，而下图显示了以b-肌动蛋白为参照的Fas蛋白的光密度分析。 （B）上图描绘了在所有测试的三组中capase-3的代表性印迹，下图描绘了以b-肌动蛋白为参比的相同的光密度分析。（C）上图代表健康，患有不受控制的糖尿病和患有慢性非愈合性伤口的不受控制的糖尿病患者的Bcl-2蛋白表达的蛋白质印迹，而下图则显示了以b肌动蛋白作为参照的Bcl-2蛋白表达的光密度分析。 （D）上图代表健康，患有不受控制的糖尿病和患有慢性无法治愈的伤口的不受控制的糖尿病的患者之后Bax蛋白表达的Western印迹，并且下图显示了以b-肌动蛋白为参照的Bax蛋白表达的光密度分析。数据表示为平均W SD（每组n = 30）（与健康人相比*** p <0.001；与无并发症的非控制性糖尿病和慢性非治愈性糖尿病相比，## p <0.01和#p <0.05每个面板中的第一，第二和第三栏分别代表健康，不受控制的糖尿病患者和患有慢性无法治愈的伤口的不受控制的糖尿病患者。

4 讨论

糖尿病的患病率正以惊人的速度增长，就直接医疗保健支出和治疗糖尿病并发症的费用而言，糖尿病正给经济造成沉重负担。 T2DM积累的证据支持以下假设：高血糖会导致ROS的产生，最终导致各种组织中氧化应激的增加[26]。从T2DM患者获得的淋巴细胞显示ROS积累，膜损伤，蛋白羰基增加，SOD和过氧化氢酶活性改变[27]。抗氧化酶超氧化物歧化酶，过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶可保护人体的各个组织免受氧化损伤。 SOD通过将超氧自由基转化为H2O2并随后进行解毒来清除自由基。在我们的研究中，与H组相比，DC和D组中抗氧化酶SOD的水平更高，这可能是为了抵消糖尿病状态下自由基的产生。

SOD的活性在D组和DC组之间非常重要。在DM和有无并发症的DM患者中，也有DM和红细胞中SOD活性增加的报道[28]。在其他报告中，SOD活性没有变化[29]。在对DM SOD水平另一方面上次报告表明水平的降低，并违背了我们的研究结果[30]。

与H组相比，D和DC组中的过氧化氢酶活性均降低，因为H组与D组和DC组相比没有显着差异。 CAT活性的降低可能是由于酶糖基化导致的失活。糖尿病期间已观察到红细胞中CAT的活性降低，由于超氧化物自由基和过氧化氢的积累，这可能导致许多有害作用[31]。

在2型DM中，随着疾病持续时间和并发症的发展，血浆硫代巴比妥酸反应物（TBARS）的水平明显升高。与年龄相匹配的对照组相比，2型DM患者的白细胞脂质过氧化增加，抗坏血酸水平降低[32]。新诊断的2型DM患者的血清MDA水平高于配对对照[33]。在我们的研究中，我们还发现与H组相比，DC和D组的MDA水平升高。与没有足溃疡和非糖尿病对照的糖尿病患者相比，患有糖尿病足溃疡的患者血清中的MDA水平升高[34]。

谷胱甘肽可以预防糖尿病，心脏病，肾衰竭和失明等并发症[35]。低细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）以及参与GSH稳态的关键酶，γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）和谷胱甘肽-S转移酶（GST）的不平衡分布，说明了糖尿病患者外周血单核细胞（PBMC）的氧化状态增加患者[36]。与健康对照组相比，DM患者无论有无并发症，其红细胞中的GSH含量经常被消耗掉。我们的观察结果表明，与H组相比，D组和DC组的GSH总体降低。D组和DC组之间的GSH浓度显著降低。

高血糖症中氧化应激的增加会诱导多种细胞反应，包括活动性细胞死亡以及基因激活和增殖。在GSH耗尽的细胞中，较低浓度的二酰胺可以诱导Caspase-3（-like）蛋白酶的活化和细胞色素c的释放以及细胞凋亡。这些结果表明，耗尽GSH的细胞对氧化应激更为敏感[37]。高糖诱导的凋亡（其中涉及ROS）导致Caspase-3的触发并促进人内皮细胞的凋亡[38]。我们的结果表明，与H组相比，D组和DC组的淋巴细胞中Caspase-3的表达明显更高。与D组和DC组相比，该值也显着更高。与Bax相关的细胞死亡也发生在由氧化应激诱导的高血糖状态中[39]。

高糖水平通过激活糖尿病患者的Bax表达并下调Bcl-2导致内皮功能障碍。我们发现与H组相比，D组和DC组中Bax的显着表达以及D组和DC组之间的Bax显着表达。这些观察结果与先前的DM患者视网膜中Bax表达的rep活性更高有关[40]。

目前的数据显示，与H组相比，D组和DC组中Bcl-2的表达明显降低。这些观察结果与先前的报道一致，该报道表明Bcl-2在糖尿病人成年视网膜中的低表达[41]和在DM患者的胎盘中[42]。关于高血糖状态下Bcl-2的表达，存在一些有争议的报道。在Abu-El-Asrar等人进行的研究中 [43]，在患有DM的人类受试者的视网膜中，发现与非糖尿病受试者相比，糖尿病人视网膜的神经胶质细胞Bcl-2上调。 Galkowska等 [44]还证明与正常静脉溃疡相比，Bcl-2在糖尿病溃疡边缘的高表达。

ROS在Fas介导的细胞死亡中的作用已得到很好的确立[45]。 Fas介导的细胞凋亡与T2DM有关，可能与高血压及其血管后果有关。当其配体Fas配体（FasL）（II型膜蛋白的成员）与其结合时，Fas会诱导凋亡信号。在人的动脉粥样硬化斑块中已发现Fas和FasL的表达增加[46]。 Van der Vliet等人进行的一项研究。 [47]从健康个体获得的血细胞中，与单核细胞相比，粒细胞中的Fas表达明显降低；而Fas表达在淋巴细胞与单核细胞或粒细胞之间没有显着差异。我们的结果表明，与H组相比，D和DC组之间以及D和DC组之间的Fas在D和DC组的淋巴细胞中具有显着活性。

总之，我们的数据共同证实了淋巴细胞GSH和过氧化氢酶活性的显著降低以及SOD和MDA活性的增加反映了糖尿病状态下（无论是否有糖尿病伤口）的氧化应激升高。在有和没有伤口的DM淋巴细胞中，Fas，Bax，Caspase-3的高表达和Bcl-2的表达降低，证实了氧化应激与细胞凋亡之间的密切关系。氧化应激和细胞凋亡的增加进一步加剧了伤口愈合的延迟，并增加了糖尿病患者感染的机会。将来，该研究可用于更好地了解糖尿病伤口中的淋巴细胞凋亡，但仍需要进行详细的研究以探索所有可改变细胞凋亡效应机制以增强免疫力的标志物。

致谢

作者A.K. Arya和D. Pokharia女士感谢CSIR和印度ICMR的财政支持。作者还感谢勒克瑙印度毒理学研究中心的Ashutosh Kumar先生以及BHU IMS的Heisht Kumar先生的Manish Mishra博士，BHU IMS的支持和帮助。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。