Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、 底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。
ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）
ECL Western特异发光检测试剂盒用于辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白或核酸检测。下面以engreen的超敏型ECL发光液Enlight-Plus为例，说一下检测实验步骤。
1. 常规电泳、转膜、HRP 标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。以下操作在室温进行。
注意：Enlight-Plus 推荐的抗体稀释度为:
储存液浓度为1mg/ml 的一抗推荐稀释度 储存液浓度为1mg/ml 的二抗推荐稀释度
1:1000-1:5000 或 0.2-1.0μg/ml1:2000-1:10,000 或10-50ug/ml
2.新鲜配制发光工作液。将BufferA 和Buffer B 按1:1 比率混合，制成发光工作液(每1cm2膜需要0.125ml 发光工作液)。转移到清洁的塑料小盒中。
3. 用镊子将漂洗过的膜取出，将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的洗液，但勿使膜完全干燥。将膜转移至有发光工作液的塑料小盒中，使其完全浸泡，轻轻摇晃，室温孵育几十秒到1 分钟。
4. 用镊子将膜夹起5-10 秒，并将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的发光液，迅速将膜完全包裹于洁净保鲜膜内，去除气泡和褶皱，蛋白面朝上固定于X 片暗盒内。
5. 在黑暗中一次重叠放入3 张X 光胶片，30 分钟或更长时间后全部取出显影。
6. 对同一张膜进行多次蛋白杂交：用PBST 或TBST 洗涤掉发光液（10min×3 次），然后从开始一抗杂交即可。
ECL的使用注意事项：
1. 发光液不宜暴露于强光下时间过久，请避光保存，在暗室操作。
2. 为了得到最佳的曝光效果，优化一抗、二抗的稀释比例。
3. 请选择高质量保鲜膜。
4. 对于Enlight发光液，应避免使用NaN3 回收HRP 偶联的抗体，因为NaN3 能抑制HRP 的活性。
