2020.3.17#鉴于liftover转坐标不给力，我用了ncbi的Remap，使用方面看这篇参考
https://www.jianshu.com/p/41e5280f59c3
还可以选BED转GTF，但是没结果，还是老老实实转bed吧。
秀一下liftover和remap的结果比对，基本一致
所以就用这个bed文件构造我的saf文件，但是后来发现不管是liftover还是remap都会有random还有unknown chr的存在，需要手动把这一部分的基因组坐标删去。
sed '/random/d' cageenhancer38.saf > cageenhancer381.saf
sed '/chrUn_KI/d' cageenhancer381.saf > cageenhancer382.saf
删掉之后就可以featurecounts了。
2020.3.15#liftover转坐标
- 首先转一下cage enhancer的hg19tohg38坐标，用的是liftover
wget http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/liftOver
下载到biosoft/ucsctools，记得存readme，（后来不这么下了，下到我自己的文件夹里和seq数据一起
2 .liftover的使用
借鉴文章https://www.jianshu.com/p/c6da6f4dadd3
https://www.plob.org/article/9541.html
linux版需要gblic2.17，不知道怎么弄，就用网页版做完了，下载到本地然后上传转格式
更：https://blog.csdn.net/u011262253/article/details/99056385这个文章介绍了怎么解决gblic not found的问题，然并卵，我不敢用sudo处理
上传到服务器的bed文件，被在线的liftover重新塑造了格式，用gawk重新编辑一下
用了三个gawk文件处理分别是
a. mksaf.gawk
BEGIN{FS=":"; OFS="-"}
{print $0,$1,$2}
gawk -f mksaf.gawk ./hglft_genome_6b6bf_c72f70.bed > tmp1.bed
#hglft这个是liftover处理过上传的bed
b.mksaf1.gawk
[yujia@cluster enhancer]$ cat mksaf1.gawk
BEGIN {FS="-"; OFS=""}
{print $1,"-",$2," ",$3," ",$4," ",$5}
gawk -f mksaf1.gawk ./tmp1.bed > tmp2.bed
其实可以用printf处理，更加方便
c. mksaf2.gawk
这次把+-3000的操作加进去，做出saf文件
[yujia@cluster enhancer]$ cat mksaf2.gawk
{
text1= ( $3 + $4 ) / 2 - 3000
text2= ( $3 + $4 ) / 2 + 3000
printf "%s %s %d %d %s\n",$1,$2,text1,text2,"."}
#不知道为啥有科学计数，于是我用printf处理了一下格式
gawk -f mksaf2.gawk ./tmp3.bed > cageenhancer38version.saf
对于下载好，并且完成sra转fastq的数据，进行hisat2比对
hisat2比对
参考https://www.jianshu.com/p/4253c595bdd3
https://www.jianshu.com/p/479c7b576e6f
https://bbs.csdn.net/topics/393548188
hisat2 -t -q -X 500 -x /data/yujia/biosoft/ref_data/genome/ensemble_38_93/Homo_sapiens.GRCh38.93_genome_tran
-1 /data/yujia/jzm/aml/data/RNAseq/SRR8366760.sra_1.fastq -2 /data/yujia/jzm/aml/data/RNAseq/SRR8366760.sra_2.fastq -S SRR8366760.bam
-t，输出载入index和reads比对所花的时间
-q，输入为fastq文件
-p，指定线程数
-X，指定fragment的最大长度（最小长度为-I），默认500，设置以后，不支持gap比对，-X和-I数值相差越大，运行越慢
-x，指定索引文件
-1，指定双端测序中第一个文件
-2，指定双端测序中第二个文件
-S，指定输出sam文件的文件名
下面是sam转bam
for ((i=3;i<=7;i++));
do
samtools view -S SRR01428${i}.sam -b > SRR01428${i}.bam
samtools sort SRR01428${i}.bam SRR01428${i}.sorted
samtools index SRR01428${i}.sorted.bam
#这个index感觉不需要
done
#比对一定要用readname进行sorts
合并同一生物学重复的bam
samtools merge groalign1.merge.bam SRR014283.sorted.bam SRR014284.sorted.bam SRR014285.sorted.bam
samtools merge groalign2.merge.bam SRR014286.sorted.bam SRR014287.sorted.bam
所以理论上我应该先排序，不用index，然后merge，merge之后保持着sorted的目录，然后直接index就可以了
qsub -l h_vmem=20G,p=10 -q all.q
featurecount
https://www.bioinfo-scrounger.com/archives/407/
https://www.jianshu.com/p/e9742bbf83b9
featureCounts -- verbose -F SAF -T 6 -p -a /data/yujia/jzm/aml/data/enhancer/cageenhancer38version.saf -o /data/yujia/jzm/aml/data/enhancer/GROseq_featureCounts.txt /data/yujia/jzm/groseqtest/sra/groalign1.merge.bam
-a 输入GTF/GFF基因组注释文件
-p 这个参数是针对paired-end数据
-F 指定-a注释文件的格式，默认是GTF
-g 从注释文件中提取Meta-features信息用于read count，默认是gene_id
-t 跟-g一样的意思，其是默认将exon作为一个feature
-o 输出文件
-T 多线程数
hisat-featurecounts-deseq2的流程
https://www.jianshu.com/p/13b1b728f101
https://pzweuj.github.io/2018/07/18/rna-seq-4.html
https://www.jianshu.com/p/27bf1e144d55
这是是非常好的有saf文件如何用的流程
http://www.bio-info-trainee.com/2022.html
http://www.bio-info-trainee.com/745.html
这是htseqcount和bedtools计数的区别，因为我只有bed，featurescount不支持，那么用bedtools计数行不行呢？？
https://blog.csdn.net/Cassiel60/article/details/89310811
bed计数的流程
https://www.jianshu.com/p/05aae63d7c52?from=singlemessage
虽然是做chip-seq的，而且chip-seq的流程非常亲民，但是也介绍了gtf文件格式的构建问题。如果saf文件还不能用，我就还是构建个gtf文件吧。。更新，saf又可以用了，还是用saf比较简单。
https://www.jianshu.com/p/69b15fbb2b5a
介绍GTF格式，里面有一个enhancer的gtf，但是我也没看懂。。。
DEseq2的使用流程
https://www.jianshu.com/p/26511d3360c8
标准化的原理
http://www.360doc.com/content/18/1007/19/51784026_792756336.shtml
hisat-stringtie-balldown三连
https://www.jianshu.com/p/1f5d13cc47f8
三组数据的差异性分析
https://www.sohu.com/a/209245114_464200
https://www.sohu.com/a/209245114_464200
https://www.jianshu.com/p/e2828ef9c7e5?from=singlemessage
http://blog.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=118204&do=blog&id=1222648
洲更的转录组
https://www.jianshu.com/p/5f94ae79f298
洲更的富集分析
https://www.jianshu.com/p/5c8c6a380939
洲更的差异分析，有对角线图的画法
https://www.jianshu.com/p/b55276e46f0c
这个还有我三组数据一起处理的可行性，很重要
https://www.jianshu.com/p/ffa11736092a
洲更的水稻实战文章，图挺好看的
绘制热图
https://blog.csdn.net/XIUXIU179/article/details/79975702
http://www.biomarker.com.cn/archives/15215
https://www.jianshu.com/p/b55276e46f0c
GO分析
介绍
https://www.jianshu.com/p/49ceeae7fd95
https://www.cnblogs.com/wangshicheng/p/10123859.html
操作
https://www.jianshu.com/p/5c8c6a380939
https://www.jianshu.com/p/e8e04f34fd7c（这个全一点）
enrichGO默认gene type是entrezID，但其他OrgDb支持的类型（ENSEMBLE，SYMBOL等）都可以通过参数keyType指定。
gene的ID type不一样，富集的结果也会有稍微的差异。
原gene list是entrezID，直接通过bitr转换成ensembl和symbol，分别做enrichGO。
发现entrezedID可能对应多个ENSEMBL的。
entrezedID和SYMBOL是一一对应的
1）因为ensembl在库中多个ID会对应同一个entrez，因此四个数值都要大一些
2）entrez和symbol 可能是因为是在db中是一一对应？，因此结果一模一样。
3）Y叔建议尽量不用SYMBOL做enrichGO。
糖
链接：https://www.jianshu.com/p/e8e04f34fd7c
来源：简书
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https://www.jianshu.com/p/056902a2e3a9
这个解决了GO分析的代码，用这个
GO富集分析示例
https://blog.csdn.net/devcloud/article/details/94549627
RPM FPKM 等概念详解与计算
http://blog.sciencenet.cn/blog-1113671-1038659.html
