测序知识.png
测序过程和原理
一代测序（Sanger测序）
- 原理：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，得到片段大小不一致的DNA混合物，然后通过凝胶电泳分离和放射自显影后识别确定待测分子的DNA序列。
- 特点：读长长（1000 bp），准确性高（99.999%），通量低。
二代测序（NGS测序）
- 原理：边合成边测序（Sequencing by Synthesis，SBS）
在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
- 特点：通量高、时间短、读长短。
- 平台介绍
Roche公司的454技术、
Illumina公司的Solexa技术
Life technologies（ABI）公司的SOLiD技术（Ion Torrent和Ion Proton） - 流程
- DNA文库构建
将基因组DNA随机片段化，然后通过末端修复、磷酸化、加A等步骤修补成平末端，最后加上特定的接头（Adaptor），构建成DNA文库。 - 簇的生成——桥式PCR
Flowcel上面连有两种接头（P5、P7），当DNA经变性后流经Flowcell时，利用Flowcell上的接头与DNA两端的接头相互匹配。DNA进行桥式PCR扩增，从而将碱基信号放大。通过桥式PCR不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。 - 测序
- 数据产出
三代测序
- 原理：
- SMRT技术：
也采用边合成边测序方法，以SMRT芯片为测序载体，芯片上众多小孔中的DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP)，在碱基配对阶段，加入不同碱基会发出不同的光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。另外，若碱基存在修饰，则通过聚合酶的速度会减慢，因此可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间、两峰之间的距离来检测甲基化等碱基修饰情况。SMRT测序速度快（每秒约数个dNTP），但是，测序错误率也较高（达到15%，可通过多次测序进行有效的纠错）。- 纳米孔单分子测序技术：
该技术的原理是当在膜两侧施加电压，分子马达驱动DNA分子通过纳米孔，导致电荷发生变化，每种碱基引起的电流变化是不同的，通过检测这些电流进而转化为对应的碱基序列。
特点：无需PCR扩增，读长长，无视GC含量的影响。
平台
PacBio 实时单分子测序
Complete Genomics公司的复合探针-锚定连接技术
Oxford Nanopore 纳米孔单分子通道技术
Ion Torrent电子流检测技术注：以上内容均摘自微信公众号 “生信星球”
选修
Filezilla能干什么？
（1）你的电脑和你的服务器之间互传文件
（2）从数据库下载数据到你的电脑（然后传到你自己的服务器）
Filezilla是什么？
（1）filezilla是图形界面的FTP工具
（2）FTP--File Transfer Protocol，文件传输协议。
下载公共数据库里的数据。
SFTP---SecureFile Transfer Protocol，安全文件传送协议。
自己电脑和自己服务器互传。
FileZilla下载教程
百度/google上搜索 FileZilla ,进入英文官网 https://filezilla-project.org/，
- 完成下载
Filezalia的安装和使用
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你的电脑和你的服务器之间互传文件
打开Filezalia
ctrl+S打开站点管理器
用filezilla登录你的服务器
原始界面
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点击连接
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注意：主机处填入的数字是你的服务器ip地址，打开你的putty应该可以看到
- 从数据库下载数据到你的电脑
- 示例网址，复制粘贴 ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/M_musculus/ARCHIVE/MGSCv3_Release3/RNA/
-
点“快速连接”
